tokenpocket官网app下载安卓|wb封闭的作用

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2024-03-09 21:53:55

Western blot中为什么要进行封闭这一步骚操作 - 知乎

Western blot中为什么要进行封闭这一步骚操作 - 知乎切换模式写文章登录/注册Western blot中为什么要进行封闭这一步骚操作科研不好找星球上的笔记本，超级科研在做Western blot实验中，会用到固相载体，在这些固相载体表面有很多孔隙（如筛子般孔洞），通过恒流湿转或半干转，凝胶上覆着的蛋白质被转移到膜上，蛋白以机械填补和吸附的方式结合于膜表面。蛋白印记到有很多微米级孔洞的NC膜，但是蛋白并不是连续的，而有很多空隙，抗体也是蛋白，也会被吸附在空的孔，这样就会有很多非特异性的信号。为防止这些位点与抗体结合引起非特异的染色和背景，一般用惰性蛋白质或非离子去污剂封闭膜上的未结合位点来降低抗体的非特异性结合。封闭剂应该是具有封闭所有未结合位点而不替换膜上的靶蛋白、不结合靶蛋白的表位，也不与抗体或检测试剂有交叉反应的特性。抗原或抗体包被时所用的浓度较低，吸收后固相载体表面尚有未被占据的空隙，封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥在其后的步骤中干扰物质的再吸附。封闭液中的蛋白能够狠牢固的结合在空白位置上，这样抗体蛋白就不会被非特异性的吸附到膜上，而只会跟特异性蛋白结合。Western的灵敏度某种程度上受限于封闭做的好不好。Western blot转膜后的封闭液的选择应该根据实验的具体要求和条件来决定，不同的封闭液可能会对实验结果产生不同的影响。除了封闭液的选择，还有一些注意事项会影响Western blot转膜后的封闭效果。首先，封闭液的温度和时间应该根据实验的具体情况来决定。一般来说，低温封闭液可以减少非特异性抗体的形成，但同时也可能会影响特异性抗体的结合。因此，需要根据实验的目的和要求来选择适当的温度和时间。根据实验的目的和条件，可以选择不同的封闭缓冲液。例如，对于蛋白质表达较低的样品，可以选择含有高浓度封闭试剂的缓冲液，以提高非特异性结合的抑制效果；而对于蛋白质表达较高的样品，可以选择含有低浓度封闭试剂的缓冲液，以避免影响特异性条带的表达。其次，封闭液的pH值也会影响非特异性抗体的形成。一些封闭液的pH值可能不适合某些抗原的保护，因此需要根据实验的具体情况来选择适当的pH值。除了封闭试剂的选择，封闭步骤的时间和温度也是影响实验结果的重要因素。一般来说，封闭时间不宜过长，以避免非特异性信号的干扰；同时，温度也要适宜，以促进抗原抗体的有效结合。此外，封闭试剂的浓度和膜的清洗次数等因素也会对实验结果产生影响，需要进行适当的调整和优化。一般是将在膜封闭液中4℃下脱色摇床孵育1-2小时左右，封闭孵育后，在TBST缓冲液中冲洗膜3次（每次5min）。除了提到的脱脂牛奶、BSA、酪蛋白和封闭凝胶溶液，还有一些其他的封闭液也可以用于Western blot转膜后的封闭操作。例如，一些实验室会使用封闭血清，如山羊血清或兔子血清，作为封闭液，它们可以为膜上的抗原提供更好的保护。此外，一些实验室还会使用特定的封闭剂，如抗氧化剂或抑制剂，来减少非特异性抗体的形成。总之，封闭步骤是Western blot实验中不可或缺的重要环节，需要认真遵守实验操作规范，选择合适的封闭试剂和条件，以确保实验结果的准确性和可靠性。封闭液的质量和纯度也是影响封闭效果的重要因素。如果封闭液的质量和纯度不高，可能会影响非特异性抗体的形成，从而影响实验结果的准确性。发布于 2024-01-25 19:05・IP 属地湖北western转膜封闭赞同 3添加评论分享喜欢收藏申请

WB的无敌战神之路——封闭 - 知乎

WB的无敌战神之路——封闭 - 知乎切换模式写文章登录/注册WB的无敌战神之路——封闭PTMBio景杰生物WB做得好，导师捡到宝。对于刚入实验室的热血青铜宝宝，WB可谓处处都是轰炸区，一个不小心，分分钟落地成盒。为了帮助大家快速get变强秘籍，提升吃鸡率，我们在此重磅推出《WB实验全攻略》系列文章，助力各位早日成为实验室MVP，进阶WB无敌战神。在上一期的分享中，我们介绍了如何湿转 (WB的无敌战神之路——转膜)，今天将接着介绍封闭，我们开始吧～封闭的目的：蛋白通过非共价作用力吸附于膜表面，但是膜上很多位置并未吸附蛋白，封闭液中的蛋白成分可以与膜表面的空白位置结合，从而避免一抗的非特异性结合，产生非特异条带或者背景杂乱。01|封闭液的选择正确的封闭液可以促使抗原抗体更好的结合。对于封闭液的选择，可以通过抗体说明书确定有无特殊的封闭方法，也可根据实验结果进行相应调整。小编在这里给大家总结了常见的封闭液以及它们的优缺点。Ⅰ 脱脂奶粉脱脂奶粉成分复杂，含有多种蛋白，封闭全面。大部分情况下，脱脂奶粉是首选的封闭液 (浓度2.5-5% w/v)，经济实惠，可以达到较好的封闭效果。但因含少量残留的生物素和碱性磷酸酶 (AP)，它不适用于生物素标记和AP标记的抗体系统。脱脂牛奶也不适用于磷酸化蛋白的检测分析，因为奶粉中含有的酪蛋白是一种磷酸化蛋白，会导致抗体的非特异性结合，使条带背景变脏。Ⅱ 牛血清白蛋白 (BSA)脱脂奶粉不能用于磷酸化蛋白的封闭，分析磷酸化蛋白理论上要用BSA (浓度2-5 % w/v)。WB结果显示，相较于脱脂奶粉，BSA更适用于磷酸化蛋白的检测。遥想当年，我还不知道磷酸化蛋白封闭需要用BSA，一个磷酸化蛋白我整整跑了一个月，总是背景高，血的教训哪！虽然BSA成分单一，但普通级别的BSA可能含有IgG或其他血清蛋白，这些蛋白会与哺乳动物抗体 (如抗牛、山羊、绵羊、马等二抗) 产生交叉反应，增加非特异性背景信号，因此建议使用不含IgG的BSA产品。相对于脱脂奶粉，BSA不含生物素，对于生物素标记的抗体系统而言，可能BSA是最好的选择。Ⅲ 血清血清如胎牛血清FBS含有大量的蛋白质，可以用于封闭。但与BSA一样，它含有免疫球蛋白和血清蛋白，这些蛋白会和哺乳动物抗体产生交叉反应，增加非特异性背景信号。而且血清价格更加昂贵，需要的浓度更高 (5-10 % w/v),因此在WB实验中血清一般用的较少，它更多地应用于免疫组化和免疫荧光实验中样本的封闭。Ⅳ 明胶明胶是胶原蛋白的产物，从冷水鱼皮肤中提取出来的明胶即使在低温情况下也不会凝固，通常使用浓度为0.1-5 % (w/v)。与BSA和血清不同，它不含任何血清蛋白，因此不会和哺乳动物抗体产生交叉反应，这大大降低了非特异性背景信号。但鱼胶含有内源生物素，因此不适用于生物素标记的抗体系统。Ⅴ 混合封闭液有研究表明[1]，混合型液封闭效果 (脱脂奶粉+BSA+FBS+明胶) “秒杀”前四种封闭液。如图1所示，不难看出，混合型封闭液的封闭效果最好，信号最强 (该实验使用的是HRP标记的抗体系统)。图1 不同的封闭液对高分子量蛋白CFTR表达的影响/Nitrocellulose：NC膜；FBS：胎牛血清；Gelatin：明胶；Blotto：脱脂奶粉；Mixture：混合液Ⅵ 酪蛋白相对于AP标记二抗，HRP标记二抗灵敏度更高，酶促反应更快。绝大多数实验室用的都是HRP标记二抗。如果有实验室用的是AP标记二抗，小编建议用1 % w/v的酪蛋白进行封闭。酪蛋白在中性和碱性条件下带有负电，会与带正点的膜相互作用，可以用于AP标记的抗体检测系统，缺点是溶解性相对较差~02|封闭的流程01、转膜结束前30 min，以TBST为缓冲体系 (配方见文末) 配置封闭液，并利用涡旋仪、摇床等仪器使封闭液充分溶解并混匀；02、转膜结束后，在抗体孵育盒中加入适量封闭液，并用镊子夹住条带，将其完全浸泡在封闭液中，置于摇床上室温摇动孵育1-2 h，也可以4 ℃冰箱孵育过夜。03|问题解析WB的结果不理想有很多原因，下面我们就分析一下封闭可能会导致的问题吧～1. 条带上有黑色斑点奶粉未完全溶解。出现黑点最常见的原因是奶粉没有完全溶解，建议利用涡旋仪、摇床等仪器使奶粉充分溶解并混匀，或溶解后离心取上清液使用。图2 条带上有黑色斑点2. 条带背景高封闭时间过短。封闭的目的是使封闭液中的蛋白成分与膜表面的空白间隙结合，从而避免一抗的非特异性结合。封闭时间过短可能会导致一抗与空白间隙非特异性结合，背景变脏，可以增加封闭时间，或提高封闭液浓度。图3 条带背景高3. 条带信号弱过度封闭。条带信号弱，可以适当降低封闭液浓度，或者更换封闭液，封闭时间如果过长也可以考虑降低，但如果原本时间是1 h，不建议再缩短时间。但封闭过度很少见，条带信号弱可能要优先考虑其他条件，比如样品新鲜度、上样量、一抗二抗浓度等。图4 条带信号弱04|TBST配方发布于 2023-02-16 11:05・IP 属地浙江科学实验赞同 2814 条评论分享喜欢收藏申请

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全程剖析Western blot原理，你才能掌控它。 - 知乎

全程剖析Western blot原理，你才能掌控它。 - 知乎首发于Western blot踩雷和制作大全切换模式写文章登录/注册全程剖析Western blot原理，你才能掌控它。聊点学术AI病理+量化病理方案设计上上期，我在自己的公众号推出了Western blot(WB)最全避雷手册，反响不错。同时，有人在公众号后台私信我，说他(她)的朋友最近被WB烦的不行，希望能够再出几期，解答他们在WB中遇到的难题。个人思考后觉得，应该从WB原理开始，一步一步捋下来，所谓知其然而知其所以然。让我们红尘作伴，共同努力，驾驭WB实验。Western blot可大致分为以下7步，分别是蛋白提取、蛋白定量、SDS-PAGE电泳、电转印、封闭、抗原-抗体免疫反应、蛋白检测。为此，我将从头到尾剖析WB原理，希望为大家答疑一二。WB是一种把电泳分离的组分从凝胶转移到一种固相支持物(NC膜或PVDF膜)，并以针对特定氨基酸序列的特异性试剂作为探针检测。WB采用抗体作为探针，抗体可以与附着在固相支持物的靶蛋白的抗原表位发生抗原-抗体免疫反应。这种技术的作用是对细胞或组织提取的蛋白混合物(即总蛋白混合物)中的某一特异蛋白进行鉴别和半定量分析，旨在鉴别特异性蛋白的类型(如亚型、聚体、剪切体等)和蛋白表达量的变化。一、蛋白提取常规的样品无外乎3种，分别是培养的细胞、动物组织(磨碎或剪碎至肉眼观察无颗粒)、术中切割的肿瘤细胞。这些样品需要在裂解液或强去污剂中充分裂解，细胞中的物质(总蛋白、基因、其它内容物等)才能释放出来，随后离心取上清液(即总蛋白混合物)。常用的裂解成分大多包含Triton X-100、NP-40、十二烷基硫酸钠等，这些成分具有较强的表面活性作用和还原作用，可将细胞膜或核膜裂解，释放其中的物质。同时，裂解液中还包含其它成分，如Tris-Hcl作为缓冲剂，可防止蛋白在提取过程中变性；以及Nacl，可防止提取的蛋白由于非特异性的聚集而形成聚体等。不同公司生产的裂解液成分大同小异，多是以上成分按不同比例组成，可分为弱、中、强三种不同裂解能力的裂解液。最重要的是我们要清楚自己研究的蛋白到底在细胞哪里表达，是细胞膜、胞浆还是细胞核。这决定我们该使用哪种强度的裂解液。如果裂解不充分，我们抽提的总蛋白中可能已经不包括目标蛋白或目标蛋白随着沉淀物被丢弃，那么整个WB实验从一开始就悄无声息地失败了。二、蛋白定量为什么要蛋白定量？首先要知道WB的目的是什么。WB是要比较同样细胞数量的细胞或同等重量的动物组织中目的蛋白的表达量高低变化。那么首先，我们需要控制样品本身重量大小或细胞数量的多少对实验结果的影响，故不同组间的样本需要控制一致才能提取蛋白。因此，在第一步中提取的蛋白上清液即是同等质量下，同样提取方法下，抽提的总蛋白混合物，这里面包含了各种各样的蛋白。我们必须知道这个上清液中的总蛋白浓度，才能在第三步电泳时保证每一个上样孔中加入的总蛋白质量一致，这样后面对条带上的蛋白定量分析才是有意义的。我们怎样才能知道这个上清液中，总蛋白的浓度呢？目前有4种方法，分别是双缩脲法、Lowry法、Bardford法和BCA法。较常用的是BCA法，其原理：蛋白质可在碱性环境下将2价铜离子还原为1价铜离子，而1价铜离子可以与BCA试剂发生颜色反应，2分子的BCA螯合后可形成紫色的复合物，这种复合物具有非常好的吸光性(用OD值反应)。在562nm的紫外光下，溶液中复合物的OD值与蛋白浓度在一定范围内呈现良好的线性关系。我们可以通过这种线性关系大致地计算出自己的样品中总蛋白浓度。自然而然，我们需要一个OD值-蛋白浓度标准曲线。购买商用的蛋白标准品(即包含已知浓度的蛋白溶液)，一般有25μg/μl、5μg/μl、4μg/μl三种。首先，按照(铜离子体积：BCA regent体积=1：50)配制BCA工作液。准备好4mg/ml蛋白标准品，使用去离子水倍比稀释蛋白标准品，最后配成2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0等共8个不同浓度的蛋白溶液，单位μg/μl。随后将自己的要测的样品按照一定倍数稀释(因为待测样品的蛋白浓度肯定是过高而超过BCA检测的线性范围，稀释倍数根据样本类型和经验来定)。采用96孔板，每孔中加入200μl的BCA工作液和20μl待测样品(一个孔一个样品，如待测样品数量为15，则一共使用标准蛋白梯度浓度的8个孔+15=23个孔，个人建议每个孔做2个复孔，防止加样误差)。随后放入37℃孵育箱，孵育30min，促使发生紫色螯合反应。孵育结束后立刻拿到酶标仪中，在562nm光下，测算每一个孔的OD值，并通过标准蛋白梯度浓度和其相应的OD值用EXCEL表得出OD值-蛋白浓度线性公式(R方值建议0.99以或以上)；同时根据待测样品的OD值和上述公式计算出每一份样品中总蛋白的浓度。定量好的蛋白根据体积比例加入5X或者1X的蛋白上样缓冲液，96℃以上水浴10min，使蛋白充分变性，解除二级或三级结构，只保留一级链式结构。上样缓冲液一般成分及作用：SDS，可使得蛋白裹上足量的负电荷，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异；DTT还原剂，可打开巯基维持单链的线性结构；甘油，可起沉降作用使得混合的样本沉降到加样孔底部，不会逸散至加样孔以外；溴酚蓝为小分子蓝色物质，有指示作用。三、SDS-PAGE电泳终于到了电泳时刻。电泳是为了使得我们的加样孔中同等质量的总蛋白在相同电场作用下，从配置好的凝胶中由上往下迁移。我们都学过物理，知道带电物体在电场中移动距离与物体本身的电荷、物体的质量相关。蛋白质本身的电荷、质量、结构是不同的，这些都是影响蛋白在凝胶中移动的因素。通过煮沸，我们消除让蛋白仅保留了一级结构；上一步添加的上样缓冲液中SDS消除蛋白质本身电荷的差异。那么此时，上样的总蛋白中各种各样蛋白在凝胶中的迁移距离只与蛋白的质量相关。电泳时，整个凝胶处在一个大致呈“U”型的电场中，因此市场能看到电场强度过高时，整条溴酚蓝呈现微笑的形状。借助电泳时的电场力作用，首先总蛋白在较小电压下移动到浓缩胶和分离胶的交界处，此时见溴酚蓝呈现一条笔直的蓝线；随后，在高电压的作用下，所有孔道中的蛋白会同时开始向下迁移，一定时间后，总蛋白中各种蛋白会在分离胶中的不同位置中分离开，分离后蛋白所处的水平位置只与蛋白分子量大小有关。分子量大的蛋白靠上，而分子量小的蛋白靠下，溴酚蓝则在最下面的位置。每一种分子量的蛋白会在分离胶中形成一条直线，当然我们是看不见这条线的，这也是为什么我们要加溴酚蓝的目的，溴酚蓝刚好跑出最下方玻璃板时，电泳就可以停止了，否则你关注的小分子量蛋白可能会跑出胶外。我们可以通过彩色的Marker来大致地确定目标蛋白在哪里。电转印的时间和电转强度需根据蛋白分子量来决定。四、电转印电转印就是将凝胶中的蛋白，转移到固相支持物上，即常用的NC膜和PVDF膜。这两种膜表面都有肉眼不可见的小孔，都可以用来电转印。NC膜全称硝酸纤维素膜，带负电荷的蛋白质可以与膜发生疏水作用而结合到一起，价格便宜，韧性差易碎，但易于封闭非特异性结合；PVDF膜全称聚偏二氟乙烯膜，使用前需用无水甲醇活化(膜表面的正电基团可被无水甲醇活化)，易于吸附蛋白质，价格贵，韧性强，适合小分子量蛋白电转印。电转时，电场是垂直于我们的凝胶和膜的。因此凝胶中的蛋白质再次在电场作用下向紧贴着凝胶的膜上转移，并最终被吸附在膜的表面。我们可以通过丽春红染色大致地评价电转印的情况(丽春红可将膜上调的蛋白染成红色，而膜其它位置基本不着色)，但是丽春红染色仅仅是粗糙的评价方法，并不是我们的目标蛋白是否转移到膜上的直接证据，做＞150KD分子量蛋白的同志们尤其得注意。电转印的时间和电转强度需根据蛋白分子量来决定。五、封闭一旦电转印结束，我们就开始了封闭的过程，常采用5%、8%的脱脂奶粉或胎牛血清，室温下，摇床孵育膜1h。常规采用奶粉即可，但是做磷酸化蛋白或某些特殊蛋白时必须使用胎牛血清封闭，因为奶粉中含有大量酪氨酸，可使磷酸化蛋白的条带变浅，甚至消失，同时也可能出现较高背景。为什么要封闭呢？我们知道，电转后蛋白质已迁移至膜的表面，此时膜上还存在大量的、未吸附蛋白质的小孔。此时我们采用牛奶或胎牛血清封闭，其中包含大量的蛋白质，这些蛋白质会吸附在那些小孔上，堵住这些孔。如果没有封闭，那么在下一步我们添加的一抗将同时吸附在目标蛋白和膜表面其它位置，且很难洗掉，最终ECL发光检测时可出现非特异性条带、杂带、高背景等等，浪费抗体不说，还会影响最终的判断。当然，这些奶粉中的蛋白也会一定程度地吸附到目标蛋白表面，但是抗原-抗体特异性反应相比，这种非特异性的结合会很轻松的在后面漂洗步骤中消除。有时候也会遇到未封闭，但没有出现杂带。对此，我只想说，常在河边走，哪有不湿鞋啊。六、抗原-抗体免疫反应这一步是比较简单的。就是你购买的特异性抗体与你的目标蛋白发生抗原-抗体特异性免疫反应。首先是一抗与目的蛋白表面的抗原表位结合，而膜表面其它位置的孔因为被封闭过程中牛奶的蛋白质说填满，因此结合量很少，后面漂洗时可去除。比较重要的是一抗孵育温度和时间，最常用的条件是4℃摇床过夜孵育，温度适宜，分子运动温和。有人也用37℃孵育1-2h，可能会成功，但是温度越高，分子间的运动越激烈，那么出现非特异性杂带的可能性就越高；同时孵育时间较短，也可能会导致一抗与目标蛋白结合不充分。当然，如果你使用的是多克隆抗体，那情况就更难说了，参考上上期避雷手册。一抗结合之后，就是采用的二抗，二抗可与一抗结合，而二抗蛋白结构被HRP辣根过氧化物酶标记，可与发光底物相结合，该底物极强的信号输出能够使皮克量的蛋白得到检测。总之，选好自己的一抗是很重要的。特异性高的一抗，WB你怎么做都能出；特异性差的抗体，WB发明人都不一定做得出来。建议不要省钱买国产抗体，你懂得。买抗体之前，看看近年发的高分文章，查查他们用的什么哪个公司抗体。如果找不到参考，一定要买经过该抗体公司敲除验证过的抗体。七、蛋白检测前几步，我们几乎无法看到膜上有啥变化，条带也看不见在哪，反正就是一直将膜洗洗涮涮。终于到了蛋白检测，这也是WB最后一步，终于可以一睹蛋白条带的真容了。蛋白检测包括DAB法和ECL发光法。DAB法就是和免疫组化染色类似，出现的条带在肉眼下即可见，呈现棕黄色，条带可保存1-2年，但是现在用的较少。目前较多采用的是ECL化学发光法，ECL工作液包括鲁米诺(是的，就是我们在刑侦节目案发现场看血迹的东西)和过氧化物，二者避光保存，现配现用(1：1配制)，用时滴在膜上就行，目标条带将在黑暗环境下发出荧光，荧光会进一步胶片上曝光，荧光越强则胶片上曝光的条带越黑，最后洗出胶片即可。现在还有凝胶成像仪可以使用，省去了胶片曝光和洗胶片的步骤，方便而高效，再也不用去小黑屋待着发光了。至于胶片上的黑色条带该怎么分析，这又是另外一个话题了，今后会和大家再聊一聊。终于敲完了，已秃......欲知更多科研技能，请搜索微信公众号“聊点学术”。发布于 2020-03-18 15:17分子生物学实验医学科研赞同 126663 条评论分享喜欢收藏申请转载文章被以下专栏收录Western blot踩雷和制作大全临床医生

western blot中封闭起什么作用 - 简书

ern blot中封闭起什么作用 - 简书登录注册写文章首页下载APP会员IT技术western blot中封闭起什么作用Seurat_Satija关注赞赏支持western blot中封闭起什么作用转膜后，膜上其他的空白位置需要用封闭液封闭。Western的灵敏度某种程度上受限于封闭做的好不好。

在做Western blot实验中，会用到固相载体(如NC膜，PVDF膜)，在这些固相载体表面有很多洞洞，通过电转，胶上的蛋白被转移到膜上，蛋白以机械填补(堆积)和吸附的方式结合于表面。

蛋白塞进了表面的很多洞洞里面，但是蛋白并不是连续的，而有很多空隙，抗体也是蛋白，也会被吸附在空的洞里，这样就会有很多非特异性的信号。

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扩展资料：

封闭液中的蛋白可以与固相载体表面的空白位置结合，以机械填补(堆积)和吸附覆盖的方式结合在膜上，填补和覆盖蛋白结合位点以避免非特异性结合。同样，这两种作用使封闭液中的蛋白能够狠牢固结合在空白位置上，这样抗体蛋白就不会被非特异性的吸附到膜上，而只会跟特异性蛋白结合。

封闭液应封闭所有的未结合位点而不替换表面上的靶蛋白，不结合靶蛋白表位，也不与抗体或检测试剂有交叉反应。

转膜后，膜上其他的空白位置需要用封闭液封闭。Western的灵敏度某种程度上受限于封闭做的好不好。

©著作权归作者所有,转载或内容合作请联系作者人面猴序言：七十年代末，一起剥皮案震惊了整个滨河市，随后出现的几起案子，更是在滨河造成了极大的恐慌，老刑警刘岩，带你破解...沈念sama阅读 145,866评论 1赞 309死咒序言：滨河连续发生了三起死亡事件，死亡现场离奇诡异，居然都是意外死亡，警方通过查阅死者的电脑和手机，发现死者居然都...沈念sama阅读 62,394评论 1赞 260救了他两次的神仙让他今天三更去死文/潘晓璐我一进店门，熙熙楼的掌柜王于贵愁眉苦脸地迎上来，“玉大人，你说我怎么就摊上这事。” “怎么了？”我有些...开封第一讲书人阅读 96,852评论 0赞 214道士缉凶录：失踪的卖姜人文/不坏的土叔我叫张陵，是天一观的道长。经常有香客问我，道长，这世上最难降的妖魔是什么？我笑而不...开封第一讲书人阅读 41,592评论 0赞 186港岛之恋（遗憾婚礼）正文为了忘掉前任，我火速办了婚礼，结果婚礼上，老公的妹妹穿的比我还像新娘。我一直安慰自己，他们只是感情好，可当我...茶点故事阅读 49,465评论 1赞 263恶毒庶女顶嫁案：这布局不是一般人想出来的文/花漫我一把揭开白布。她就那样静静地躺着，像睡着了一般。火红的嫁衣衬着肌肤如雪。梳的纹丝不乱的头发上，一...开封第一讲书人阅读 39,091评论 1赞 180城市分裂传说那天，我揣着相机与录音，去河边找鬼。笑死，一个胖子当着我的面吹牛，可吹牛的内容都是我干的。我是一名探鬼主播，决...沈念sama阅读 30,669评论 2赞 279双鸳鸯连环套：你想象不到人心有多黑文/苍兰香墨我猛地睁开眼，长吁一口气：“原来是场噩梦啊……” “哼！你这毒妇竟也来了？” 一声冷哼从身侧响起，我...开封第一讲书人阅读 29,435评论 0赞 172万荣杀人案实录序言：老挝万荣一对情侣失踪，失踪者是张志新（化名）和其女友刘颖，没想到半个月后，有当地人在树林里发现了一具尸体，经...沈念sama阅读 32,820评论 0赞 217护林员之死正文独居荒郊野岭守林人离奇死亡，尸身上长有42处带血的脓包…… 初始之章·张勋以下内容为张勋视角年9月15日...茶点故事阅读 29,534评论 2赞 221白月光启示录正文我和宋清朗相恋三年，在试婚纱的时候发现自己被绿了。大学时的朋友给我发了我未婚夫和他白月光在一起吃饭的照片。...茶点故事阅读 30,865评论 1赞 233活死人序言：一个原本活蹦乱跳的男人离奇死亡，死状恐怖，灵堂内的尸体忽然破棺而出，到底是诈尸还是另有隐情，我是刑警宁泽，带...沈念sama阅读 27,312评论 2赞 218日本核电站爆炸内幕正文年R本政府宣布，位于F岛的核电站，受9级特大地震影响，放射性物质发生泄漏。R本人自食恶果不足惜，却给世界环境...茶点故事阅读 31,810评论 3赞 214男人毒药：我在死后第九天来索命文/蒙蒙一、第九天我趴在偏房一处隐蔽的房顶上张望。院中可真热闹，春花似锦、人声如沸。这庄子的主人今日做“春日...开封第一讲书人阅读 25,703评论 0赞 9一桩弑父案，背后竟有这般阴谋文/苍兰香墨我抬头看了看天上的太阳。三九已至，却和暖如春，着一层夹袄步出监牢的瞬间，已是汗流浃背。一阵脚步声响...开封第一讲书人阅读 26,135评论 0赞 170情欲美人皮我被黑心中介骗来泰国打工，没想到刚下飞机就差点儿被人妖公主榨干…… 1. 我叫王不留，地道东北人。一个月前我还...沈念sama阅读 33,844评论 2赞 236代替公主和亲正文我出身青楼，却偏偏与公主长得像，于是被迫代替她去往敌国和亲。传闻我的和亲对象是个残疾皇子，可洞房花烛夜当晚...茶点故事阅读 33,990评论 2赞 239推荐阅读更多精彩内容全程剖析Western blot原理，你才能掌控它。最近有人在微信后台私信小编，说他(她)的朋友最近被WB烦的不行，希望能够再出几期，解答他们在WB中遇到的难题。小...聊点学术阅读 1,538评论 0赞 8Western blot实验最常见的10个问题及解决方案1. Western Blot原理Westernblot的原理是蛋白质在电力场的作用下，由大到小的进行排列，利用...英格恩阅读 805评论 0赞 5小鼠β-actin基因的克隆与表达[摘要]：基因工程实验技术主要内容包括目的基因的获取、重组表达载体构建与转化、阳性克隆的鉴定、目的蛋白的诱导表达、...木木子kinoko阅读 7,996评论 1赞 8免疫共沉淀免疫共沉淀原理及步骤免疫沉淀（Immunoprecipitation, IP）原理 IP是利用抗原蛋白质和抗体的...xiaosine阅读 2,563评论 0赞 8如何优雅地做出高逼格的Western Blot？Western Blot（WB），蛋白免疫印迹法，一句话，定性、定量检测蛋白表达的一种经典、有效的技术方法。将电...薄荷Lemon阅读 47,615评论 8赞 86评论0赞44赞5赞赞赏更

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western blot是为了什么？ - 知乎首页知乎知学堂发现等你来答切换模式登录/注册实验western blot是为了什么？本人大一，刚进实验室，师兄简单讲了遍原理步骤就开始让我每周跑一次，我每次都是很机械的操作，想知道最后的图像能看出什么来?为什么要做wb?关注者143被浏览181,170关注问题写回答邀请回答好问题 15添加评论分享15 个回答默认排序科研根号三江苏赛尔普生物，流式实验、单细胞测序、蛋白芯片、免疫检测等关注这篇内容的收藏越来越多了，发现大家都喜欢收藏但是不喜欢点赞，各位老铁们收藏的时候记得双击给我点个赞同啊~题主能提出这个问题，证明你真的很适合做科研，因为你不只是机械性做事，你还会思考。但是你可以胆子再大一点，除了做实验，你还可以找师兄师姐多交流，同时自己多学习，这样在交流的时候不至于有太多的知识盲区。关于western blot实验的原理（为什么要做这个实验），实验结果怎么看。以及做不出想要的结果该怎么办，这些问题你可以看下我今天的分享。另外如果你想系统的学习western blot实验，你可以学习下我分享这些关于Western blot实验技术的学习资料，链接分享给你。Western blot学习资料汇总链接：https://pan.baidu.com/s/1NfzHs1ZxvGdWIxIzu8iuEg?pwd=hv6x 提取码：hv6x 额外分享：有需要的小伙伴可以自行下载~免费，亲测安装！56个科研人必装软件安装包（11月更新）实验数据/图片处理+文献管理+科研绘图+写作翻译+统计分析+办公常用链接：https://pan.baidu.com/s/1JkjM67dHoKsY3K5AkLGrTg?pwd=6868 提取码：6868 western blot作为免疫学三大实验之一，是所有生物医药科研人必须要掌握的实验之一。WB，是Western blotting的缩写，即蛋白质印迹法，又称免疫印迹（immunoblotting）,也就通过电泳技术分离不同组分，再采用印迹技术将蛋白质转移（“印”）到特定的膜上，再利用抗原-抗体的特异性结合原理，用抗体作为探针去实现检测复杂样品中的靶标蛋白的方法，这项技术也可以用来检测不同时期蛋白表达的水平以及蛋白相互作用等方面。WB由来1975年，英国人Edwin Mellor Southern发明了基因组DNA特定序列定位的方法：将待测定DNA分子从琼脂糖凝胶中转移到一定的固相支持物硝酸纤维素膜（NC膜）上，即印迹（blotting），然后膜上的核酸与同位素标记的探针在一定的温度和离子强度下杂交，检测特定DNA片段，并将这种方法命名为Southern印迹法；后来Alwine又用类似方法检测RNA，正好与DNA相对应，故被称为Northern印迹杂交；1981年Burette成功将对单向电泳分离后的蛋白质分子转印到膜上并进行免疫学分析（如抗体抗原特异性结合），这种印迹分析称为Western印迹法；而Eastern blotting是Western blotting的变形，只是检测对象变成了双向电泳后的蛋白质分子（所谓的双向电泳是等电聚焦-聚丙烯酰胺凝胶电泳（IEF-PAGE）分离蛋白质）。实验原理WB实验是通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）将混合蛋白质样品分离后，利用特殊虹吸或电场装置印迹至与相对应的第一抗体特异性结合，之后再与酶或同位素标记的第二抗体相结合，最终通过底物显色或放射自显影来检测特异性目的基因表达的蛋白成分。Western Blotting先使用PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）电泳分离出待检测的蛋白质，再用电场装置印迹至固相介质（如PVDF膜）上，固相介质以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及生物学活性不变。再以膜上的蛋白质片段作为抗原，与一抗（“探针”）特异性结合起免疫反应，再与酶或同位素标记标记的二抗结合，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。实验流程SDS-PAGE凝胶电泳：（1）分离胶①配制：根据蛋白分子量大小确定合适的凝胶浓度后，可参考凝胶配置试剂盒中的说明书（如目标GFP蛋白为25kDa，采用8%-16%梯度浓度的胶），或自行参考文献配置。依次加入所需试剂于配胶专用烧杯中，轻轻并缓慢吹打胶溶液以混匀，用移液枪吸取液体和打出液体速度应至少保持在2-3s左右。注意：放液时不能全部放出，否则容易产生气泡，影响实验结果（有气泡的地方不导电）；配胶的APS需要在4℃的冰箱中保存；胶在加APS与TEMED促凝剂前一定要混匀其他组分。电泳凝胶制备参考浓度②灌胶：配10％分离胶，加入TEMED后立即摇匀就可开始灌胶。灌胶时，可用移液枪吸取胶沿玻璃板壁缓缓放出注入胶室，待胶面升到绿带中间线高度时即可。再次强调注意控制速度，避免气泡。然后加入适当剂量的纯水或无水乙醇以封胶，以盖住分离胶为准。③凝胶：在室温下开始凝胶30min。注意：凝胶过程中胶板应当保持稳定，不可晃动，否则导致分离胶液面不平。④倒压胶液：当压胶液和分离胶之间有一条折射线时，说明胶已大致凝固。再等大约3min，胶就充分凝固。此时将压胶液倒入废液缸，并用吸水纸伸入两板间的胶室将残留的压胶液吸干，但要注意别碰到分离胶表面。（2）浓缩胶①配制：与分离胶操作一致，只是所需试剂不同。②灌胶：配4％的浓缩胶，加入TEMED后立即摇匀灌胶。灌胶操作参考分离胶灌胶。③插样品梳：灌胶后立即将样品梳缓慢插入凝胶中，样品梳插入后应与胶板保持平行，不应倾斜。④凝胶：大约20min浓缩胶凝固，双手用食指与拇指捏住梳子，缓慢轻轻竖直向上拔出梳子，切记不要拔歪，保证齿口整齐。（3）电泳将胶板放入电泳槽中，并加入1×Tris-甘氨酸或SDS电泳缓冲液，入足量的样品和合适的蛋白marker。电泳槽连接电泳仪。上槽接负极,下槽接正极，通电起始电压80V，10min后100V，电泳2h或当溴酚蓝迁移至离底部1cm时，停止电泳。注意不能让溴酚蓝跑出去。转膜转膜指的是把蛋白从凝胶转移至特定材质的膜上，我们本次采用PVDF膜，不同膜的性质不同，具体详情参考表2。依据胶的大小裁剪膜和滤纸6张，置于缓冲液中平衡10min。PVDF膜则需用纯甲醇浸泡湿润1-2s。采用“湿转移”，即把“三明治”黑板-海绵-3层滤纸-胶-膜(正面朝下，分清左右，与胶对应)-3层滤纸-海绵-白板依次放好，并完全浸入缓冲液中湿透操作（注意：黑色板的一面对黑色负极，湿转过程中不能干，轻轻用刮板赶走气泡）。湿转完成后，夹紧板放入湿转电转槽内，在转膜槽中加满电转液，插上电极（100V，1h），开始转膜。转膜槽置于有冰袋的泡沫箱中，保证电转一直处于低温下进行。转膜结束后，切断电源，取出杂交膜。封闭与孵育转膜之后迅速置于Tris-Buffered Saline(TBS)中，于回旋振荡器上室温下漂洗5min，以便移除残留的转移缓冲液。随后将膜用TBST从上向下浸湿后，转移至含有封闭液（TBST做溶剂，配5%脱脂牛奶）的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭2h或4℃过夜封闭（PVDF膜在甲醇活化后是带电的，因而在转膜时会将蛋白吸附，所以封闭的目的就是要将PVDF膜上无蛋白的部分空隙用奶粉填满，以免孵抗体的时候一抗二抗与之结合，产生非特异条带或者是背景杂乱）。一抗：加入合适稀释浓度的一抗（用TBST稀释），室温，脱色摇床孵育1h；TBST室温脱色摇床洗3次，每次10min（一抗只能结合能与其特异结合的蛋白，其他没有结合的就被洗下来了）二抗：加入合适稀释度（用TBST稀释）的碱性磷酸酶(AP)或辣根过氧化酶(HRP)标记的二抗，室温，脱色摇床孵育1h；TBST室温脱色摇床洗4次，每次5min（二抗只能结合能与已结合蛋白的一抗结合，其他没有结合的就被洗下来了）显色辣根过氧化物酶HRP-ECL发光法：用微量移液器取等体积的ECL试剂中的A、B发光液放在EP管中恢复至室温，按比例稀释混合。用去离子水稍微漂洗PVDF膜，再用滤纸贴脚吸去膜上残余液体，将膜平放，反贴法覆于A、B混合液滴上，避光反应3分钟，可适当延长；舍弃ECL混合液置于暗盒中曝光显影，曝光时间控制在30s左右。取出胶片立即完全浸入显影液中 1～2min，清水漂洗一下后放在定影液中至底片完全定影，清水冲净晾干，标定Marker，进行分析与扫描。WB灰度分析关于WB结果的灰度分析，可以看下面这篇WB异常结果盘点与原因解析12个高频异常结果#1 无背景无条带经验分享上图展示一点信号都没有，大部分情况是因为抗体加错了。如果中间出现细微的条带，可能是蛋白上样量太少，一抗浓度过低，ECL 发光液失效。#2 高背景经验分享高背景是 WB 实验中最常见的问题，目的条带单一清晰，但其他地方又弥漫性较均一的背景（比较连续的）。杂带多大概率是抗体特异性不好，也有可能抗体浓度太高，可尝试降低一抗浓度进行实验。#3 非特异性条带经验分享此种情况绝大多数是因为一抗不好，你无法判断哪一条是目的条带。如果实在没有更好的抗体，建议采用阴性对照和阳性对照来确定上述哪个条带是目的条带。当然也有一种很小几率的可能是一抗浓度太高引起的非特异性结合。#4 条带中出现边缘规则的白圈经验分享我们常常将电转液倒入一个盘子里，倒入的液体不宜太多或太少，建议高度与放上第一层滤纸齐平，然后往滤纸上浇点转膜液，往胶上面浇点电转液，用两只手的拇指和食指轻轻夹住 NC 膜的两侧中间，使膜成 U 型，然后将 U 型底部接触胶的中间，慢慢往两边放下膜，这样一般气泡很少。然后上层滤纸同样用 U 型的放置方法，用玻璃棒稍微贴实下，最后盖上海绵。#5 出现黑点和黑斑经验分享牛奶溶解后，最好静止一下，然后轻轻吸取上层牛奶进行封闭，封闭结束后一定要洗 3 遍之后再加一抗。#6 条带拖尾经验分享这种情况一般出现在大分子量抗体实验中，是因为一抗浓度太高，作用时间太长引起的。另外洗一抗和洗二抗千万不要偷工减漏，建议 5min*5 次，不要担心洗这么多次把抗体和蛋白洗掉了，真正的抗原抗体相结合通过这种方式是洗不掉的。#7 出现非均一性背景经验分享封闭时洗一抗洗二抗，以及发光时都应时刻注意切记蛋白面风干，一旦风干很可能会导致这个结果。#8 某个条带变形经验分享很多实验室中使用的不是最新设备，比如配胶用的海绵垫，如果用了很多年，会从下面往上面漏小气泡，当气泡足够小并且胶快凝固的时候，走到中间的小气泡就停留在胶内，并会影响到后面的跑胶。另外配胶用的水，SDS，Tris 缓冲液要注意不要有杂质。#9 条带不均一经验分享出现哑铃最大的可能是胶没有配好，胶凝固后不均一。如果你拔完梳子后出现上图中下面部分的情况，多半会出现哑铃状。另外还有一种可能是样品中含有太多杂质，没有离心下来，然后杂质沉积在孔的中间，蛋白自然被推挤到两边。#10 最边缘条带弯曲经验分享一般我们使用的是 10 孔的胶，如果你上样刚好 10 个孔，那么最两头的两个孔肯定会歪曲。另外上样最好在胶的中间，这样电场均一#11 条带笑脸，marker正常经验分享准备样本主要确认上样缓冲液是否为近期配置，并且要妥善保存，否则就会浪费珍贵的实验样本。一般电泳过程中恒压电泳，浓缩胶 80V，分离胶 120V，整个过程差不多需 2 个小时左右。#12 曝光结果条带扭曲经验分享对于大分子量的抗体，跑胶前可以先把样本煮一下，然后稍微离心一下，同样也可以改善这种情况。7个灵魂提问#1 为啥条带形状不好看？可能的原因有：a.胶凝的不均匀或聚合不好，建议灌胶前将溶液充分混匀b.某些样品盐浓度较高，建议除盐或将样品盐浓度调成一致c.缓冲液陈旧，成分改变,可以重配d.凝胶下面有气泡,电泳前要先将气泡赶走e.电泳时温度过高，可以降低电流或电压f.样品中含有不溶性颗粒，建议样品充分搅拌混匀#2 蛋白条带位置（大小）不对咋整？可能的原因有：a.胶浓度不对，不同浓度的胶跑出的蛋白条带的位置可能有所偏差，可以调整浓度b.抗体孵育不充分,建议增加抗体浓度，延长孵育时间c.酶失活，建议直接将酶和底物进行混合，如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物d.目的蛋白存在翻译后修饰或剪切体，建议查询相关文献确定e.标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低，建议设置阳性对照比对结果，增加标本上样量#3 暗背景上白色带是咋回事？可能的原因有：a.抗体与封闭试剂反应，建议使用前过滤封闭试剂b.HRP含量过高，建议降低酶联二抗的浓度c.HRP偶联二抗中有聚集体，建议过滤二抗试剂，去除聚集体d.抗体分布不均匀，建议孵育抗体时使用摇床#4 细胞提取液中没有检测到目的蛋白？可能的原因有：a.细胞中不表达这种蛋白质，换一种细胞；b.抗体不能识别目标蛋白，多看看说明，是否有问题；c.可能是没有保持低温操作，样品保存不当，样品放置时间过长；d.细胞中的蛋白质被酶降解掉了，可加入蛋白酶抑制剂，抑制蛋白酶活性。#5 目的带很弱，如何加强？a.可以加大抗原上样量，这是最主要的；b..也可以将一抗稀释比例降低；c.还可以延长曝光时间。#6 我做的蛋白质分子量很小(10KD)，怎么做WB?a.可选择孔径0.22um的PVDF膜或者NC膜，转膜时间缩短，另外可采用Tricine-SDS-PAGE体系；b.也可以选择PSQ 膜，同时缩短转移时间。也可以将两张膜叠在一起，再转移。其他按步骤即可。#7 有很多杂带咋回事？可能的原因有：a.目的蛋白有多个修饰位点，本身可以呈现多条带，建议查阅文献或进行生物信息学分析，获得蛋白序列的修饰位点信息，通过去修饰确定蛋白实际大小b.样本处理过程中目的蛋白发生降解,建议加入蛋白酶抑制剂；样本处理时在冰上操作c.杂蛋白多，建议处理目的蛋白d.抗体特异性不强，建议使用特异性强的抗体e.抗体孵育时间过久，建议减少抗体孵育时间f.二抗与抗原有交叉反应，建议选择合适的封闭物g.二聚体或多聚体存在，建议增加蛋白质变性过程及强度h.底物显色与曝光时间过长，建议缩短显色及曝光的时间电泳和转印环节的 11 条 TipsTip 1：洗净上样孔在加样之前，用移液枪吹洗每个上样孔，洗净残留在上样孔中的丙烯酰胺残渣，从而避免畸形条带的出现。Tip 2：凝胶过热是大忌如果凝胶在电泳过程中温度过高，则条带可能会出现「微笑」形状，即条带两侧向上弯曲的现象。切记要正确使用缓冲液，并控制好电泳功率，避免凝胶过热的出现。Tip 3：确保样品缓冲液离子强度正确样品中的盐离子强度过高（或过低），都会导致条带出现偏斜或扭曲。如果样品提取过程中用到高盐溶液，就有可能要在上样前进行稀释或脱盐处理。Tip 4：不要过载上样加大上样量有利于检测稀有目标蛋白。但过大的上样量会导致电泳过程中出现垂直条纹。如果必须大量上样时（> 30 ug 总蛋白），可将电泳电压降低 25％，有助于减少条纹。Tip 5：转印三明治要去除气泡均匀的蛋白质转印需要三明治的各组件之间完全接触，尤其是凝胶和膜完全接触。没有去除的气泡会导致膜上出现空白点，直接影响实验结果！建议使用凝胶滚轮将这些气泡通通赶走！（提示：梯度凝胶最好上下滚动，而不是左右滚动。左右滚动会导致梯度凝胶翘曲和起皱。）Tip 6：转印前的预平衡湿转和传统半干转时，将凝胶电泳缓冲液替换为转印缓冲液可获得更好的转印效果。电泳缓冲液的带入会增加电导率，从而导致转印过程中产生过多的热量。可在水中短暂冲洗凝胶，然后在转印缓冲液中平衡凝胶 15 分钟，平衡膜 5 分钟。请注意，对于某些快速转印系统，不建议使用凝胶预平衡，请遵循制造商的操作指南。Tip 7：NC 膜转印时避免使用 SDS转印缓冲液中的 SDS 会降低蛋白质与硝酸纤维素膜的结合效率，所以在使用 NC 膜时要避免缓冲液体系内有 SDS。转印前用水冲洗凝胶，以便减少 SDS 带入转印体系。Tip 8：PVDF 膜可使用 SDSSDS 可以促进蛋白质从凝胶中洗脱，如果某些蛋白质难以从凝胶中洗脱，则可以将 SDS 添加到转印缓冲液中，前提是必须使用 PVDF 膜。Tip 9：避免膜变干在转印之前和之后均需保证膜的湿润，从转印三明治中取出后，转印热量会使膜容易变干燥。应迅速将膜浸入预先准备好的缓冲液中，以免膜干燥。（尤其是在使用 PVDF 膜时要格外注意，因为 PVDF 膜是疏水的更容易变干）。如果干了，可将硝酸纤维素膜重新在缓冲液中浸湿，而 PVDF 膜则需要在醇中重新活化。Tip 10：半干转印功率及时间设置使用高电场转印可获得更高的转印效率，但是一定要注意系统的散热能力，避免凝胶过热。转印期间，「三明治」温度升高会导致电阻变化，进而引发转印效率不均一，缓冲液失去缓冲能力，甚至凝胶融化。半干转印在电流下降接近为零时，延长转印时间不会增加转印效果。Tip 11：使用两张膜判断蛋白是否会转穿薄胶或低浓度胶转印过程中蛋白容易转穿，特别是针对小分子量蛋白。可以转印时叠放两张转印膜，然后对第二张膜进行总蛋白染色（丽春红或 Stain-Free 免染）的方法来判断是否已经转穿。提高跑胶质量的7条TipsTip 1：蛋白分子量偏高或偏低可能是胶的浓度与目的蛋白的浓度不对应，比如说 100KD 的蛋白你用 12% 的胶跑，或者说 20KD 的蛋白你用 8% 的胶跑。Tip2：蛋白质降解蛋白质降解后很可能会在比原来位置低的地方出现主带，然后出现一些其他带，最主要的特点是所有的条带比正常的都低，并且条带模糊不清晰。Tip3：所有条带连成一片无间隔最可能是上样量过多，其次是样品弥散（比如电泳长时间停止样品弥散）。Tip4：溴酚蓝拖尾样品溶解不好或上样前未变性完全。Tip5：纵向的纹理上样样品中存在不溶性颗粒。Tip5：溴酚蓝很粗浓缩胶浓缩效果不好，可能是浓缩胶太短或者配错。Tip7：在分离胶中跑不动Tris-Cl pH 值不对，或者忘记加 SDS。推荐内容绝密！2023年国自然立项清单表可下载（生命科学部+医学科学部），附往年1000+份中标标书！如何查看国家自然科学基金的的摘要和下载结题报告？有哪些好用的zotero插件?有什么适合药学/生物方向科研小白的简单易学的科研绘图工具？有没有什么很好的科研作图软件？顶级图像分析软件，Image J、Fiji、Image pro plus，一次帮你搞定！ NoteExpress和EndNote相比哪一个更好用？（附安装包）2023年更新！EndNote X9永久激活版本（序列号激活），最稳定，可汉化！写的太全了，Endnote 插入文献以及调整参考文献格式，这是知乎上最好的教程！太牛了！Zlibrary回归，这里有最稳定的访问指南！western blot是为了什么？如何学习和记忆细胞信号通路？最值得推荐装！GraphPad Prism 9.3 ，功能更多！SPSS 27 安装激活，授权日期到期时间2037年收藏越来越多啦，感谢大家对内容的认同，也麻烦各位老铁们双击点个赞同，非常感谢~❥(^_-)编辑于 2023-12-11 16:31赞同 44516 条评论分享收藏喜欢收起酸菜科研等 2 个话题下的优秀答主关注Western blot(蛋白印迹)作为科研研究中最为平常的实验，却蕴含了很多知识，可谓是小实验里却有大文章。尽管绝大多数研究僧在接触该实验时都会被虐的体无完肤，却也在和WB斗志斗勇的过程中积累了不少经验。正所谓前人种树，后人乘凉，现在我就把各位前辈做WB的各种经验总结起来，全文如下↓同时，也为大家整理了一份实验 Protocol 资源包。标书、毕业论文都能用上！包括不同研究水平实验技术Protocol，常见细胞动物实验技术总结，不同实验方法全流程，WB实验流程、注意事项、数据处理及写作，IHC实验流程、操作技巧、注意事项、图像分析等，全都是经过前辈们无数次验证过的，绝对靠谱！搭配5节PCR免费课程，希望你科研不愁。点击免费领取正文开始。WB实验的基本常识WB的基本原理在电场的作用下将电泳分离的多肽从聚丙烯酰胺凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测，经常用于目的蛋白的表达特性分析、组织定位、表达量分析及与其他蛋白的互作。依其原理，可分为两种方法：A、直接法和B、间接法。两种的方法的优缺点比较：WB的一般流程：蛋白的提取需谨记：好的蛋白是WB成功的一半！经验总结：1.合适的盐浓度下，保持蛋白质的最大溶解性和可重复性。2.尽量除去核酸、多糖、脂类等干扰分子3.提取蛋白质过程中，应在低温环境下进行，以抑制蛋白酶的水解作用（可加入适合的蛋白酶抑制剂）。4.蛋白样品建议分装后冷冻干燥或直接以液体态置-80℃中保存，不要反复冻融。5.蛋白浓度低时，可使用超滤膜浓缩或者用真空冻干机将蛋白冻干。电泳凝胶浓度与蛋白分离范围经验总结：1.上样时：根据蛋白表达丰度调整蛋白上样量，尽量保证每孔上样量保持一致。2.胶最好现配现用，如果需要保存，最好用湿润的保鲜膜包好并置于4℃冰箱中。3.为了检测整个实验系统或校准实验结果，需要设置内参（一般指由管家基因编码表达的蛋白）。4.为了确保western blot结果的准确性和特异性，设置合适正确的对照是必不可少，一般需要设置的对照如下：阳性对照：明确表达检测蛋白的组织或细胞，用于检测抗体的工作效率；阴性对照：明确不表达检测蛋白组织或细胞，用于检测抗体的特异性；二抗对照：不加一抗，用于检测二抗的特异性；内参对照：检测标本的质量和二抗系统空白对照：不加一抗和二抗；用于检测膜的性质和封闭的效果。转膜（Western blot 成败的关键）用于western blot的杂交膜主要有两种：NC膜和PVDF膜，可依据目的蛋白与膜的结合能力及膜的孔径来挑选不同的转移膜。两个膜之间的比较：转膜方法：分为两种湿转法和半干法经验总结：1.胶在负极，膜靠近正极；滤纸不要大过膜，防止短路；2.夹好膜和凝胶后，确定在凝胶、膜和滤纸之间没有气泡存在，否则会导致转膜不完全。3.注意一定要戴手套或塑料镊子接触膜，避免手上的蛋白和油脂降低转膜效率。4.转膜过程中，尤其是高电流快速转膜时，通常会有非常严重的发热现象，最好把转膜槽放置在冰浴中进行转膜。5.对于湿转法：一般转膜的电流在200mA-400mA之间，转膜时间为30-60分钟。也可以在15-20mA转膜过夜。大片段的>50KD的可以选用350mA,小片段的可以用250mA。具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，目的蛋白的分子量越小，需要的转膜时间越短。免疫印迹经验总结：1.常见的封闭液有5%脱脂奶粉、BSA和Western Blot膜封闭液（生物试剂公司提供）。但是封闭液的选取具体得看抗体说明书，有的抗体是明确要求只能用BSA，而封闭液浓度的选择也是具体得看抗体的要求，但是一般情况5%BSA会比5%牛奶的效果好。2.选择抗体时，一方面需要考虑所选抗体是否能识别凝胶电泳后转印至膜上的变性蛋白，另一方面需要考虑所选抗体是否会引起交叉反应条带。WB结果定量分析WB做完后，有时需要对结果进行定量。然而最备受推崇的定量分析软件Quantiy One软件因其高昂的售价令很多人望而却步，但除了该软件外还有一个比较简单的图像处理软件ImageJ可以很方便的进行灰度和密度分析。ImageJ的软件界面1.ImageJ对WB条带进行灰度分析1）File|Open打开WB结果图片2）图片类型设置：Image|Type|8bit3）去除图片背景：Process|Subtract Background在Subtract Background窗口按照以下条件进行设置：4）设置定量参数：Analyze |SetMeasurements,点击Area，Mean Gray Value及Integrated Density5）设置单位: Analyze|SetScale,在“unit of length”的方框里输入“pixels”6）将图片转换成亮带，Edit|Invert7）选择Freehand Selection,尽量把条带圈起来，点击键盘m，出来IntDen灰度值8）复制数据IntDen进行分析2. Image J 对WB条带进行密度分析1）步骤同前，File|Open打开WB结果图片2）如果条带不正，需修正Image transform rotate调节angle值，直到条带水平为止3）选中矩形选项，圈中第一个条带，AnalyzeGels Select Firstlane（快捷键Ctrl +1），然后移动第一个条带上的矩形到第二个条带上，Analyze Gels Select Second Lane（快捷键Ctrl+2）,最后Analyze GelPlotlanes4）选中直线工具，将开口的波峰关闭5）选中魔棒工具，点击波峰可以显示波峰下面积，即条带的密度值6）以第一个数值为基数，其他数值与第一个数值的比值即为相对密度。WB疑难杂症最后，别忘了领取protocol资源和免费PCR实验训练营名额，标书、实验、论文都不愁。部分截图：1不同研究水平实验技术protocol针对不同研究水平的同学，我们提供不同的实验技术Protocol，帮助科研er解决实验屡战屡败难题，拓展研究思维并发展未来研究新方向。入门↓↓↓初级↓↓↓中阶↓↓↓不知如何有效设计引物？PCR电泳无扩增条带？扩增产物不符合要求？条带总和你玩“捉迷藏”？……加入解螺旋的【一周学会PCR】医学SCI实验训练营，5节课帮你快速攻克以上难关！l 课程涉及抽提细胞RNA、反转录、PCR物设、Blast引物验证、引物库使用及引物评价和修改，零基础学员亦可快速掌握实验精髓；l 从原理、流程、试剂盒到注意事项，各个要点皆事无巨细，100%玩转PCR实验l 实验结果全面解读，5分钟内挖掘结果关键信息，快速产出符合SCI的结果图；l 分享实验小技巧，针对疑难杂症对症下药，攻克实验难题避免实验过程手忙脚乱；l 快速提炼文献中实验信息，学习相关实验技能，快提炼出独属于自己的实验方案。你将掌握↓↓1.从文献提炼实验套路的能力还原文献场景，复现材料方法和结果部分写作套路2.快速通关PCR学会用软件设计引物实验，掌握PCR实验详细步骤，提高PCR实验效率3.实时解决实验疑难杂症细节决定成败，实验细节的讨论，避免实验中的手忙脚乱解螺旋高级讲师猫大老师手把手带大家从原理到流程再到注意事项理顺实验操作，各个要点皆事无巨细，新手小白也能快速掌握实验精髓！讲师介绍猫大，中国科学院上海生命科学研究院博士，现于上海交通大学医学院从事博士后研究工作，主要研究方向为表观遗传与基因转录调控。猫大硕士毕业后曾在技术公司担任实验室主管，又经博士阶段系统科学训练，实验技能极为丰富全面。亲自操刀了《酸谈实验室》课程，手把手地教学学员细胞、分子生物学实验实操技巧。授课风格严谨务实、活泼可爱，带领学员走出实验迷雾。在一周学会PCR医学SCI实验课中，不仅有细节慢慢的实验经验总结，还有亲身示范实操过程，直观真切、通俗易懂，让实验小白也能轻松掌握！加入训练营，你还将知道——PCR产物出现假阳性（即空白对照出现目的扩增产物）怎么办？PCR产物中出现假阴性或无扩增产物（即阳性对照中有条带，而样品则无条带）怎么办？提高PCR特异性的策略有哪些？克隆PCR产物的最优条件是什么？没有回收到目的片段，需要做什么对照实验？对照实验结果好，却没有回收到目的片段，实验出了什么问题？猫大老师全程教学；实时解疑答惑；关键是还免费！点击下方链接即可学习知乎专属福利从知乎报名加入训练营的小伙伴，还能获得一份protocol资源，标书、毕业论文都能用上。包括：不同研究水平实验技术protocol1400页常见细胞动物实验技术总结不同实验方法全流程表型确认WB实验流程、注意事项、数据处理及写作IHC实验流程、操作技巧、注意事项、图像分析等编辑于 2022-12-30 19:03赞同 70添加评论分享收藏喜欢

Western Blotting Immunodetection Techniques | Bio-Rad

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Introduction to Western Blotting

Western Blotting Immunodetection Techniques

Overview

Sample Prep

Electrophoresis

Transfer

Immunodetection

Image Acquisition

Image Analysis

Better Immunodetection

Information on antibodies, their selection, and use.

On This Page

Detection Overview

Blocking

Primary Antibodies

Secondary Antibodies

Detection Methods

Total Protein Detection

Tips & Protocols

Detection Overview

After transfer, proteins from the gel will be immobilized on the membrane. This section describes the process of specifically detecting your particular protein of interest in order to identify and quantify its presence and abundance in the sample. Western blot detection of proteins utilizes primary antibodies that are specific for the target protein which are then in turn recognized by secondary antibodies that are conjugated with enzymes or fluorescent molecules for detection. The correct selection and use of appropriate primary and secondary antibodies is crucial for maximizing signal while reducing background. The proper use of protein loading controls are also critical for signal normalization in quantitative western blotting. We discuss the most popular methods to detect total protein on the membrane for loading controls and their relative advantages and disadvantages.

The Immunodetection Workflow

Western Blotting Antibody Detection

After proteins are transferred from the gel to the membrane, antibodies specific to your protein of interest (primary antibodies) are incubated with the membrane to allow them to recognize their targets. A second incubation with conjugated antibodies specific to the primary antibodies (secondary antibodies) enables visualization by various methods.

Block unbound membrane sites

Membranes are incubated in a blocking agent that masks any sites on the membrane that would allow antibodies to bind non-specifically. Failure to do so raises background.

Incubate with primary antibody. Wash away excess.

Membranes are then incubated with primary antibodies that are specific to your protein of interest. These bind to their targets and any excess is washed away.

Incubate with secondary antibody. Wash away excess.

The membrane is then incubated with secondary antibodies that recognize the primary antibodies and are also conjugated to either an enzyme or a fluoroscent molecule. Any excess is washed away.

Develop signal

For secondary antibodies conjugated with an enzyme, the membrane is incubated with a chemical substrate that produces a signal that can then be detected. If the secondary is conjugated to a fluorescent label, the membrane can be directly imaged in an instrument capable of fluorescent imaging.

Blocking

Following transfer, unoccupied antibody binding sites on the membranes must be blocked to prevent nonspecific binding. Failure to completely block these sites can lead to high backgrounds that obscure the signal.

Various blocking reagents are available, and no single blocker will be optimal for all antibody/antigen combinations. The best blocker for each experiment will depend on the antibody and membrane type. Optimize the detection system for maximal signal with lowest background by testing several blocking agents. Modern formulations like Bio-Rad’s EveryBlot Blocking Buffer are universal, performing well across a wide range of targets, sample types, and detection methods.

Blocking duration also affects the signal and background levels. Blocking for 1 hour with constant agitation is a good starting point. Excessive blocking times may result in lower sensitivity as epitopes can be masked by the blocking agent and proteins washed off the membrane. In contrast, insufficient incubation times will increase nonspecific binding of the primary antibody. Advanced formulations like Bio-Rad’s EveryBlot Blocking Buffer can complete the blocking step in 5 minutes.

For detection of a phosphorylated form of a protein, blocking buffers should not contain phosphorylated proteins to avoid high background signal. Avoid use of nonfat dry milk and instead use BSA, casein, or advanced formulations that are compatible with phosphoprotein detection.

Quick Tips:

Optimizing the Blocking Step in Western Blotting

Watch the video to understand the experimental parameters and which type of blocking agent to use to ensure success of your western blot.

Agent

Pros

Cons

Non-fat milk (1–5%)

Inexpensive, widely available

Not ideal for phosphoproteins, biotin-avidin/streptavidin, or AP detection

Speckling if not completely solubilized

BSA (0.5–5%)

Recommended for phosphoprotein detection, AP/biotin-avidin detection

Not usable with antibodies created using BSA-coupled peptides, phosphotyrosine Ab

Casein (1–2%)

Balance of stringency & sensitivity

Ideal for most detection methods

Blocking may be insufficient for complex biological samples

Gelatin (1–5%)

Inexpensive, widely available

Fish gelatin does not cross-react with mammalian proteins

Porcine gelatin solidifies in cold blocking

Speckling if not completely solubilized

Cannot be used with avidin-biotin detection

Specialized

Advantage depends on product

Can be expensive

Primary Antibodies

An antibody is an immunoglobulin protein such as lgG that is generated in response to exposure to a foreign substance, or antigen. Antibodies have specific affinity for the antigens that elicited their synthesis.

Primary Antibodies

Primary antibodies are raised against a protein of interest and will selectively recognize and bind to target proteins that have been immobilized to a membrane. Antibodies can be designed to be specific for certain parts of a target protein, or they can be designed to be specific for only modified versions of the protein.

Primary Antibody Selection

Antibodies should be specific, selective, and give reproducible results. To ensure the specificity of the primary antibody, it is important to use positive and negative controls when running your blot. As a positive control, purified proteins or lysates overexpressing the target protein can be used. As a negative control, you can include secondary-antibody-only controls (omitting the primary antibody incubation step) and samples from a tissue or cell lysates known not to express the target protein such as cells engineered with a genetic knockout. Before performing the experiments review the literature in order to understand the expression profile of the protein

Selecting Primary Antibodies for Best Results in Western Blotting

Choosing a Primary Antibody for Multiplex Western Blotting

How to Select the Right Antibody

Bio-Rad has developed tips to consider when choosing your antibody.

See Antibody Tips

The wording good and bad antibody or the most specific antibody should be avoided, since a specific antibody in one sample context can give rise to high cross-reactivity in another sample context depending on the nature of the epitope(s) that it will recognize.

— Edfors et. al. 2018, Nature 9:4130

When selecting a phospho-specific antibody for your experiments, it is crucial to ensure that the antibody specifically detects the protein of interest only when it is phosphorylated at the indicated site. You might also want to consider treating cells with growth factors or chemical compounds that induce or inhibit expression of the target.

Monoclonal vs. Polyclonal Antibodies

The antibodies used to detect the target protein in a western blot will be either monoclonal or polyclonal. Polyclonal antibodies consist of a mixed pool of immunoglobulin molecules that bind to several different epitopes found on a single antigen. Polyclonals are usually produced in rabbits, donkeys, sheep, and goats, and are purified from serum.

In contrast, monoclonal antibodies bind to a single epitope within a target antigen. They are composed of homogeneous cloned immunoglobulin molecules, rather than the heterogeneous antibody mixture typical of polyclonals. Monoclonals are made by fusing antibody-producing cells from the spleen of the immunized animal (usually a rat or mouse) with an immortalized cell line to produce single specificity antibodies that can be purified from tissue culture supernatant.

Monoclonal

Polyclonal

Specificity

Specificity for a single epitope.

Varying specificities to multiple epitopes

Identification

Identifies whether a particular region of a protein is present

Identifies the entire target protein via binding at multiple sites. Since multiple epitopes are targeted, there is a higher likelihood of detection of the target

Cross-Reactivity

May cross-react with other proteins that share this epitope, such as isomers or common motifs

Higher background and cross-reactivity possible due to detection of multiple epitopes, any of which may be shared by related proteins

Sensitivity

Usually less sensitive since only a single antibody molecule binds to each target

More sensitive because signal is amplified through the binding of several antibodies per target

Cost

More expensive to produce initially, but available in an unlimited supply

Less expensive to produce initially, but supply is limited to immunized animal(s). Greater variability between preparations

Primary Antibody Incubation

After blocking, the membrane is incubated in a solution containing the primary antibody, usually diluted in blocking buffer. The time and temperature of incubation depends on the binding affinity of the antibody to the target protein and should be determined for each antibody individually. One hour at room temperature with gentle agitation is a good starting point. In order to reduce the background staining, the amount of Tween 20 used in the buffers is also important.

Antibody Concentration

The optimum antibody concentration is the dilution of antibody that still yields a strong positive signal without background or nonspecific reactions. Instructions for antibodies obtained from a manufacturer typically suggest a starting dilution range. For custom antibodies or for those where a dilution range is not suggested, good starting points are:

1:100–1:1,000 dilution when serum or tissue culture supernatants are the source of the primary antibody

1:500–1:10,000 dilution of chromatographically purified monospecific antibodies

1:1,000–1:100,000 dilution may be used when ascites fluid is the source of antibody

Quick Tips:

How to Optimize Primary Antibody Concentration and Incubation for Western Blots

Watch this video to explore considerations for optimizing incubation time and dilution of primary antibodies when performing a western blot.

See Our Western Blotting Primary Antibodies

Phospho-Specific Antibodies

Protein phosphorylation, the addition of a phosphate group to serine, threonine or tyrosine residues, is an important cellular process utilized to send cellular signals from the membrane to the nucleus. Protein phosphorylation may result in conformational changes that trigger the activation or inactivation of an enzyme.

Phospho-specific antibodies are primary antibodies that detect only the phosphorylated forms of proteins and recognize the phosphorylated serine, threonine, or tyrosine residues in the context of the rest of the protein. Using a combination of total protein detection (using primary antibodies that recognize both phosphorylated and non-phosphorylated forms of the protein) and phospho-specific antibodies, it is possible to assess the degree of phosphorylation for any given protein.

Prior to using phospho-specific antibodies, ensure that the antibodies have been validated for your experimental system. This can be accomplished by using positive and negative controls. For example, lysates from cells that are either untreated or have been treated to stimulate the pathway of interest can act as negative and positive controls. Likewise, absence of detection can act as a negative control on lysates that have been treated with lambda phosphatase to remove phosphate groups.

See Our Phospho-Specific Antibodies

Secondary Antibodies

Purification of Cross-Adsorbed Antibodies

A solution of secondary antibodies raised against mouse lgG is passed over a column containing immobilized serum proteins from potentially cross-reactive species such as rat or rabbit.

Only antibodies highly specific for mouse lgG will flow through the column, while antibodies cross-reacting to rat or rabbit will bind and remain in the column. The flow-through solution contains antibodies that specifically recognize mouse lgG.

Secondary antibodies are specific for the isotype and species of the primary antibody. For example, a goat anti-rabbit secondary is an antibody raised in goats against a primary antibody raised in rabbits.

Secondary antibodies bind to a number of different conserved regions on the primary antibody, and act to amplify the signal, increasing detection sensitivity. Secondary antibodies are labelled with either an enzyme for colorimetric or chemiluminescent detection or with a fluorescent dye for fluorescent detection of the protein of interest.

Cross-Adsorbed Antibodies

Secondary antibodies raised against primary antibodies of one species can recognize those from other species, especially if they are from closely related animals. For example, parts of the constant regions of mouse and rat antibodies are evolutionarily conserved, leading to conserved epitopes between both species. Since secondary antibodies are generally polyclonal, when generating secondaries against mouse, a subset of those secondaries will be specific for those conserved epitopes, being able to recognize them whether the epitope resides on a mouse or rat antibody. This cross-reactivity could lead to unexpected bands when multiplexing or cause high background.

To remove the undesired antibodies from a polyclonal pool, an affinity chromatography column is used to purify the secondary antibody preparation of offending cross-reactive species. Clonal antibodies that recognize the immobilized antigen(s) are removed. The unbound pool of antibodies is now cross-adsorbed against the immobilized antigen and should show no reactivity towards it.

The most common type of cross-adsorbed secondary antibody is species specific, which is most useful for multiplexing, although there are also instances when isotype-specific antibodies are required. For example, immunization with a purified IgG1 preparation might be expected to generate a serum with a specific reactivity towards IgG1 and no cross-reactivity with other antibody isotypes. However, due to the polyclonal nature of the serum combined with the conservation of some epitopes between classes and isotypes, a component of the polyclonal serum may react with an epitope on IgG1 that is also found on IgG2a, confounding the isotype specificity.

A solution of secondary antibodies raised against mouse IgG is passed over a column containing immobilized serum proteins from potentially cross-reactive species such as rat or rabbit.

Only antibodies highly specific for mouse IgG will flow through the column, while antibodies cross-reacting to rat or rabbit will bind and remain in the column. The flow-through solution contains antibodies that specifically recognize mouse IgG.

Secondary Antibody Concentration

Similar to primary antibodies, the optimum antibody concentration is the dilution of antibody that still yields a strong positive signal without background or nonspecific reactions. Fortunately, high-quality secondary antibodies are commonly available, and manufacturers typically suggest a starting dilution range.

See Our Western Blotting Secondary Antibodies

Quick Tips: How to Choose Secondary Antibodies for Multiplex Western Blotting

In this video, we discuss the best practices for selecting secondary antibodies that are compatible with your primary antibodies and your detection methods to produce high-quality, reproducible results.

Detection Methods

In the past, many different methods were used for western blot detection, but now the vast majority employ enzymatic chemiluminescence or fluorescent detection. Thus, most secondary antibodies are conjugated to an enzyme such as alkaline phosphatase (AP) or horseradish peroxidase (HRP) for use with a chemiluminescent substrate or labeled with a fluorescent compound for imaging.

Chemiluminescence Detection

Chemiluminescence is a chemical reaction in which the oxidation of a chemical substrate such as luminol is catalyzed by an enzyme, typically horseradish peroxidase (HRP), and the reaction produces light as a byproduct. The resulting light can be captured on film or by a digital imager.

Luminol emits light only weakly, so enhancers are added to the reaction to increase the signal. This enhancement of a luminol-based signal is commonly referred to as enhanced chemiluminescence (ECL). There are a number of different enhancers available, some of which can increase the signal by as much as a 1,000-fold, making ECL more sensitive than other common detection systems such as conversion of substrates to colored precipitates.

The light intensity will be roughly proportional to the quantity of your protein of interest, allowing semi-quantitation of relative protein abundance. Since this detection method relies on an enzyme-substrate interaction, the kinetics of the reaction plays a role in the linearity of the signal. Therefore, for more accurate quantitation, care must be taken to ensure that the sample load is within the linear range of the assay and the detection signal is not saturated.

Luminol oxidized by HRP in the presence of H2O2 leads to the formation of a 3-aminophthalate dianion and the release of light.

Quick Tips:

How to Image a Chemiluminescent Western Blot

Watch this video to see how to prepare a western blot membrane for chemiluminescent detection and ensure a strong chemifluorescent signal during image acquisition.

See Our Chemiluminescent Substrates »

Fluorescence Detection

In fluorescence detection, a primary or secondary antibody is labeled with a fluorescent molecule (a dye or fluorophore). A light source that produces photons within the fluorophore's excitation spectrum excites the fluorophore, and the fluorophore then emits photons with a longer wavelength. The difference in wavelength between excitation and emitted light is termed Stokes shift. This emitted light of longer wavelength can then be distinguished from the excitation light via appropriately designed optical filters and detected by a digital imager.

Fluorescence detection has a number of advantages over traditional chemiluminescent detection. As fluorescent detection does not rely on an enzyme-substrate reaction, the use of fluorophores can be more quantitative than chemiluminescent detection, is often faster, and reduces waste.

The greatest advantage of fluorescent western blotting detection over chemiluminescent detection is the ability to simultaneously detect a large number of proteins on one blot, using a process called multiplexing. This relies on choosing fluorophores that fluoresce at different wavelengths and can be distinguished by the digital imager.

Fluorophore Selection

When using fluorescence detection, consider the following optical characteristics of the fluorophores to optimize the signal:

Quantum yield — efficiency of photon emission after absorption of a photon. Processes that return the fluorophore to the ground state but do not result in the emission of a fluorescence photon lower the quantum yield. Fluorophores with higher quantum yields are generally brighter.

Extinction coefficient — measurement of how well a fluorophore absorbs light at a specific wavelength. Since absorbance depends on path length and concentration (Beer's Law), the extinction coefficient is usually expressed in cm -1 M-1. As with quantum yield, fluorophores with higher extinction coefficients are usually brighter.

Stokes shift — the difference in the maximum excitation and emission wavelengths of a fluorophore. Since some energy is dissipated while the fluorophore is in the excited state, emitted photons are of lower energy (longer wavelength) than the light used for excitation. Larger Stokes shifts minimize overlap between the excitation and emission wavelengths, increasing the detected signal.

Excitation and emission spectra — excitation spectra are plots of the fluorescence intensity of a fluorophore over the range of excitation wavelengths; emission spectra show the emission wavelengths of the fluorescing molecule. Choose fluorophores that can be excited by the light source in the imager and that have emission spectra that can be captured by the instrument. When performing multiplex western blots, choose fluorophores with widely separated emission spectra to enable good signal separation among the different color channels.

Fluorophore Stokes Shift

A high-energy photon excites a fluorophore, causing it to leave the ground state (S0) and enter a higher energy state (S11). Some of this energy dissipates, allowing the fluorophore to enter a relaxed excited state (S1). When the fluorophore returns to the ground state, a photon of light is emitted. Since some of the energy was dissipated, the emitted photon is of lower energy (longer wavelength).

The difference in wavelength between the exciting light and the emitted light is called the Stokes shift. Larger Stokes shifts minimize the overlap between the excitation and emission wavelengths, increasing the detection signal-to-noise ratio.

See Our Products for Fluorescent Western Blotting Detection »

Total Protein Detection

Total protein staining provides an image of the complete protein pattern on the blot. This information helps determine transfer efficiency and molecular weight of the transferred proteins. This information can also be used to determine relative quantity of sample that was loaded in each lane.

Several total protein stains are available and commonly used in western blotting. The table below provides an overview of total protein detection methods and applications.

Total Protein Detection Methods for Western Blotting

Detection Method

Sensitivity

Advantages

Disadvantages

Imaging

Anionic dyes (Ponceau S, Fast Green, Coomassie Brilliant Blue, Amido black)

100–1,000 ng

Inexpensive, rapid

Coomassie and Amido black are not compatible with downstream immunodetection

Epi illumination

Fluorescent stains (SYPRO Ruby and Deep Purple)

2–8 ng

Sensitive; most are compatible with immunodetection

Additional staining and destaining steps

Fluorescent capable digital imager with UV, visible light LED, or lasers

Stain-Free Imaging

2–28 ng

Rapid and convenient—ready in less than one minute, and no separate staining or destaining required. Sensitivity comparable to Coomassie

Requires use of Stain-Free Gels and compatible imager

Bio-Rad imagers

Stain-Free Imaging Technology

Bio-Rad's stain-free technology allows direct visualization, analysis, and documentation of protein samples in PAGE gels and on blots, without staining or destaining. Stain-free imaging provides equal or better sensitivity compared to Coomassie staining and eliminates organic waste disposal concerns.

Linear dynamic range provided by stain-free technology for total protein measurements. HeLa cell lysate dilutions from 80–2.5 µg total protein.

Learn More about Stain-Free Imaging Technology »

Total Protein Normalization

Bio-Rad’s stain-free technology can be used for total protein normalization of western blots. Total protein normalization uses the signal of all proteins in a sample to determine load. This approach is more robust against expression changes of any one protein to an experimental condition, which can occur when using a single “housekeeping” protein.

Learn More about Total Protein Normalization »

Immunodetection Tips and Protocols

Western Detection Tips

Use high-quality primary antibodies.

A good antibody is sensitive, meaning it can detect low amounts of your target, and is also specific, recognizing only the target, without giving spurious secondary bands. Antibody vendors are increasingly offering antibodies that have been certified for western blotting.

Use cross-adsorbed secondary antibodies.

Cross-adsorbed antibodies offer a lower chance of cross-reactivity and reduced background giving more reliable results. They are readily commercially available so they should be used whenever possible.

Optimize antibody concentration to maximize signal to background.

Sensitive detection of your target depends on high signal and low background. Reducing antibody concentration can reduce desired signal, but the greater reduction of background more than makes up for this.

For multiplex detection, first optimize antibodies to targets individually.

When detecting multiple targets simultaneously, carry out detection of each target individually first. This will simplify any needed troubleshooting.

Western Detection Protocols and Resources

Find the right products for you using the free Western Blot Selector Tool

Start Tool

Find the right products for you using the free Western Blot Selector Tool

Start Tool

Western Blotting Protocol Library

Filter by your laboratory set-up and reagents to get a custom western blotting protocol that best fits your needs.

Stain-Free Western Blotting Guide

Find out how Stain-Free technology can revolutionize your western blotting.

Better Western Blotting Guide

Tips, Techniques, and Technologies from the Western Blotting Experts at Bio-Rad Laboratories.

Protein Blotting Guide

(PDF 7.2 MB)

Details on blotting technology, methods, products, tips, techniques, and troubleshooting guidelines.

Western Blot Doctor

Our self-help troubleshooting guide covers solutions to many common and not-so-common western blotting issues and helps your blots look their best.

Best Practice for Western Blot Detection of Phosphorylation Events

Ten tips to ensure robust data generation and cleaner blots.

Protocol: Detection of Phosphorylated Proteins by Western Blotting

This protocol describes how to detect phosphorylated proteins by western blotting using Phospho-Specific PrecisionAb Antibodies.

Fundamentals of Western Blotting Course #3: Immunodetection

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蛋白质印迹（Western blot）实验方案| Abcam中文官网

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蛋白质印迹（Western blot）实验方案

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转膜与染色

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用于 western blot 的一抗

用于 western blot 的内参对照

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重组抗体 —— 优点

用于 western blot 的二抗

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IRDye® 二抗

用于 western blot 的一抗

查找合适的 HRP 二抗

荧光 WB 指南

Western blot 培训

我们的 western blot 实验方案包含溶液、试剂、检测步骤和有用的链接，可指导您完成整个实验。2020 年 12 月 14 日审核Western blot 是一项通过凝胶电泳按照分子量大小分离蛋白，然后再利用特异性抗体识别这些蛋白的技术。免疫检测通常使用由硝酸纤维素或 PVDF（聚偏二氟乙烯）制成的膜。将凝胶紧贴膜放置，蛋白在电流作用下从凝胶迁移到膜上。然后利用目标靶点特异性抗体对膜做进一步处理，再通过二抗和检测试剂让膜显色。目录溶液与试剂：裂解缓冲液溶液与试剂：电泳、转膜及封闭缓冲液样本裂解样本制备上样和跑胶蛋白转膜抗体染色相关链接网络研讨会记录查看下方的 western blot 实验方案视频。

查看更多实验方案视频，请单击访问我们的方案视频库。>> 打印完整的 western blot 实验方案>> 查看我们的 western blot 实验方案图如需提升 western blot 分析技能，请查看我们的免费 western blot 培训（可点播）。

溶液与试剂：裂解缓冲液这些缓冲液在 4 ℃ 下可保存数周，也可分装后在 -20 ℃ 下保存长达 1 年。NP-40 缓冲液150 mM 氯化钠1.0% NP-40（可用 0.1% Triton X-100 代替）50 mM Tris-HCl，pH 8.0蛋白酶抑制剂RIPA 缓冲液（放射免疫沉淀检测缓冲液）150 mM 氯化钠1% IGEPAL CA-6300.5% 脱氧胆酸钠0.1% SDS（十二烷基硫酸钠）50 mM Tris-HCl，pH 8.0蛋白酶抑制剂Tris-HCl20 mM Tris-HCl（三羟甲基氨基甲烷盐酸盐）蛋白酶抑制剂

溶液与试剂：电泳、转膜及封闭缓冲液

Laemmli 2X缓冲液/上样缓冲液4% SDS10% 2-巯基乙醇20% 甘油0.004% 溴酚蓝0.125 M Tris-HCl测定 pH 值并将 pH 值调整至 6.8电泳缓冲液（Tris-Glycine/SDS）25mM Tris base（三羟甲基氨基甲烷游离碱）190mM 甘氨酸0.1% SDS测定 pH 值并将 pH 值调整至 8.3转膜缓冲液（湿转）25mM Tris base （三羟甲基氨基甲烷游离碱）190mM 甘氨酸20% 甲醇测定 pH 值并将 pH 值调整至 8.3对于大于 80 kDa 的蛋白，建议 SDS 终浓度为 0.1%。转膜缓冲液（半干转）48mM Tris base39mM 甘氨酸20% 甲醇0.04% SDS封闭缓冲液3–5% 牛奶或 BSA（牛血清白蛋白）加入 TBST 缓冲液。充分混合后过滤。不过滤可能会有斑点沉积，这种小暗点会在显色时影响实验结果。

样本裂解细胞培养裂解液的制备将细胞培养皿放置冰上并用冰冷的 PBS 洗涤细胞。吸出 PBS，然后加入冰冷的裂解缓冲液（每 107 个细胞/100 mm 培养皿/150 cm2 烧瓶加 1 mL；每 5x106 个细胞/60 mm 培养皿/75 cm2 烧瓶加 0.5 mL）。用预冷的塑料细胞刮刀将贴壁细胞从培养皿上刮下，然后轻轻将细胞悬液转移到预冷的小离心管中。或者，用胰蛋白酶消化细胞并用 PBS 洗涤细胞，然后将细胞重悬浮于小离心管内的裂解缓冲液中。4℃ 下持续振摇 30 分钟。放入微型离心机，在 4°C 下离心。您可能需要根据细胞类型改变离心力和离心时间；指南给出的参考标准是在 12,000 rpm 转速下离心 20 分钟，但须根据您的实验确定（白细胞所需的离心力很小）。轻轻地从离心机中取出离心管放置在冰上。将上清液吸出转移到放置在冰上预冷的新管中，弃去沉淀。组织裂解液的制备3.1 用干净器械解剖目标组织，最好在冰上，并且越快越好以防蛋白酶降解。将组织放入圆底离心管或 Eppendorf 管中，浸入液氮中“速冻”。样本在 -80°C 储存备用，或放在冰上立即匀浆。对于一块约 5 mg 的组织，向管中迅速加入约 300 μL 裂解液，并用电动匀浆器匀浆，2X 裂解液冲洗刀片两次，每次 200 μL，然后在 4℃ 下（例如将回旋振荡器放入冰箱）持续振摇 2 小时。裂解液的体积必须根据组织总量决定；蛋白提取物不宜过稀释，以免造成蛋白损失，并尽量减少样本体积，以便凝胶上样。最小浓度为 0.1 mg/mL，最佳浓度为 1-5 mg/mL。在微型离心机中 4℃ 下按照 12,000 rpm 的转速离心 20 分钟。轻轻地从离心机中取出离心管放置在冰上。将上清液吸出转移到放置在冰上预冷的新管中，弃去沉淀。样本制备取少量裂解液，用于蛋白质定量分析。测定每种细胞裂解液的蛋白质浓度。确定蛋白质的上样量，并添加等体积的 2X 稀释 Laemmli 样本缓冲液。我们建议使用以下方法对样本进行还原和变性，除非在线抗体数据表显示应使用非还原和非变性条件。对样本进行还原和变性时，将样本缓冲液中的细胞裂解液在 100°C 下煮沸 5 分钟。裂解液可等量分装并在 -20°C 下储存备用。上样和跑胶3.1 将等量的蛋白和分子量标志物上样至 SDS-PAGE 凝胶孔中。细胞裂解液或组织匀浆的总蛋白上样量为 20-30 μg，纯化蛋白的上样量为 10-100 ng。3.2 在 100 V 下跑胶 1-2 小时。时间和电压可能需要优化。我们推荐按照制造商的说明进行操作。建议使用还原型凝胶，除非抗体数据表推荐使用非还原性条件。凝胶百分比取决于目标蛋白的大小：蛋白大小凝胶百分比4–40 kDa20%12–45 kDa15%10-70 kDa12.5%15-100 kDa10%25-100 kDa8%也可以使用梯度凝胶。蛋白从凝胶转移到膜膜可以是硝酸纤维素，也可以是 PVDF。用甲醇活化 PVDF 1 分钟，并在制备转膜层之前用转膜缓冲液冲洗 PVDF。转膜时间和电压可能需要优化。我们推荐按照制造商的说明进行操作。可在封闭步骤之前用丽春红染色法检查蛋白质转膜。转膜层的制备如下：

图 1.制备好的转膜层示例。

抗体染色

用封闭缓冲液在室温下封闭膜 1 小时或在 4°C 下封闭过夜。用适当稀释的一抗在封闭缓冲液中孵育膜。我们建议在 4°C 下过夜孵育；其他条件可以优化。用 TBST 洗涤膜 3 次，每次 5 分钟。用推荐稀释度的偶联二抗在封闭缓冲液中室温孵育膜 1 小时。用 TBST 洗涤膜 3 次，每次 5 分钟。产生信号时，请遵循试剂盒生产商的建议。除去多余的试剂，并用透明塑料膜覆盖膜。利用暗室显影技术采集化学发光图像，或利用常规图像扫描法采集比色检测图像。

Western Blot封闭液详解 - 哔哩哔哩

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2024年01月28日 02:00--浏览 ·

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关注WB 封闭液的主要作用有哪些？1 封闭非特异性结合位点，减少背景噪音，从而提高检测的特异性和灵敏度。封闭液中含有一些非特异性蛋白质或其他分子，可以与膜表面的非特异性结合位点结合，从而减少抗体与膜的非特异性结合，降低背景信号。2 封闭液还可以起到稳定膜的作用，防止膜在抗体孵育过程中干燥或损坏。3 封闭液还可以减少抗体在膜上的非特异性吸附，从而提高抗体的特异性和亲和力。 Western blot封闭液配方有很多，为你推荐以下几种常用的配方：5%脱脂奶粉：称取5g脱脂奶粉，溶于100ml 1xTBST。3%BSA：称取3g BSA粉末，溶于100ml 1xTBST。除了脱脂奶粉和BSA，还有一些其他常用的WB封闭液配方，比如： 5%明胶封闭液：称取5g明胶，溶于100ml 1xTBST。5%酪蛋白封闭液：称取5g酪蛋白，溶于100ml 1xTBST。封闭液的选取可参考以下建议：避免使用牛奶或牛血清白蛋白：若使用来自山羊、马或绵羊的一抗，则需避免使用牛奶或牛血清白蛋白，因为牛的IgG可能会与抗体相互作用，产生干扰。使用BSA时需注意：BSA和dry milk有时含有牛的IgG，许多其他的如抗牛、抗山羊和抗绵羊的二抗都会与牛的IgG发生反应。因此，使用BSA或dry milk进行阻断或稀释会显著增加背景并降低抗体效价。建议使用与二抗种属来源一致的标准血清进行阻断。本文禁止转载或摘编

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WB/ELISA/IHC/FC实验指南：如何选择合适的对照剂和封闭剂？ - 知乎切换模式写文章登录/注册WB/ELISA/IHC/FC实验指南：如何选择合适的对照剂和封闭剂？优宁维生物任何问题可拨打优宁维客服热线了解：4008-168-068。你是否遇到过以下几种难题，IHC实验结果不准确，背景高；多标记免疫组化实验中一抗种属来源相同时，不知该如何进行实验；IP/Co-IP后的WB实验出现非特异性条带；流式实验中没有合适的直标一抗......你是否知道通过选择正确的对照剂和封闭剂，可以帮助你解决这些实验中遇到的难题，且更容易获得准确的实验结果。本文将给大家带来流式细胞实验、WB、ELISA、IHC几大实验中常见的问题，及解决办法。流式细胞实验（Flow Cytometry）可能遇到的问题解决办法适用试剂因抗体与样本中的Fc受体相结合而产生不需要的背景对Fc受体进行封闭标准封闭血清（血清应与标记的抗体种属来源一致）使用F（ab'）2形式的二抗来防止二抗与Fc受体的结合F（ab'）2形式的二抗如何确认一抗与抗原是特异性结合使用同型对照抗体*作为阴性对照，用于显示一抗有进行特异性结合*同型对照抗体指的是一种和一抗来源相同的没有特异性的IgG蛋白ChromPure™ 纯化蛋白如何确认二抗产生的是目的信号使用同型对照抗体*作为阴性对照，用于显示二抗有进行特异性结合*同型对照抗体指的是一种和一抗来源相同的没有特异性的IgG蛋白ChromPure™ 纯化蛋白在没有直标一抗的条件下想要加快实验进度在孵育样本之前使用Fab片段抗体先与一抗孵育FabuLight™ Fab片段抗体Western Blotting实验可能遇到的问题解决办法适用试剂出现非特异性条带在用一抗孵育前，使用适当的阻断试剂阻断膜标准血清（5%v/v）（血清应与标记的抗体种属来源一致），或BSA（5%w/v）（不含IgG蛋白和蛋白酶）如果使用来自山羊、马或绵羊的一级抗体，则避免使用牛奶或牛血清白蛋白。牛的IgG可能与抗体相互作用，这是由于近缘种的同源表位。标准血清（5%v/v）（血清应与标记的抗体种属来源一致）IP后WB实验时，目标蛋白分子量位于25kDa或25kDa附近时，想要消除来自IP实验的抗体干扰为了避免检测到50 kDa的抗体重链，使用抗轻链特异性的二抗。抗轻链特异性的二抗为了避免检测到25 kDa的抗体轻链，使用单价Fab片段进行阻断后，使用抗IgG且抗Fc端特异性的二抗。抗Fc端特异性的二抗+Fab片段二抗（FabuLight™）ELISA实验可能遇到的问题解决办法适用试剂高背景在与一抗孵育之前，使用适量封闭试剂进行完全封闭标准血清（5%v/v）（血清应与标记的抗体种属来源一致），或BSA（5%w/v）（不含IgG蛋白和蛋白酶）无信号使用阳性对照证明带标记二抗的活性，并在孵育了一抗同型对照后直接用二抗来检测ChromPure™纯化蛋白❖关于使用牛血清白蛋白(BSA)和牛奶作为封闭剂的Tips：BSA和dry milk有时含有牛的IgG。除了Jackson提供的牛来源抗山羊IgG的二抗外，许多其他的如抗牛、抗山羊和抗绵羊的二抗都会与牛的IgG发生反应。因此，使用BSA或dry milk进行阻断或稀释会显著增加背景并降低抗体效价。使用与二抗种属来源一致的标准血清(5% v/v)来进行阻断是更好的选择。免疫组化实验可能遇到的问题解决办法适用试剂如何确认一抗与抗原是特异性结合使用同型阴性对照(与一抗物种相同的非特异性IgG)来证明一抗与抗原的特异性结合ChromPure™纯化蛋白高背景（General）将可能会与其他试剂结合的内源性结合位点都封闭起来标准血清（血清应与标记的抗体种属来源一致）在没有载体蛋白的缓冲液中稀释抗体，并将该混合液离心以剥离沉淀物如PBS/Tween 20等缓冲液因识别同源性免疫球蛋白而产生高背景使用经过预吸附处理的二抗来减少细胞或组织样本中相关物种之间的交叉反应经过预吸附，最大程度消除物种间交叉反应的二抗封闭内源性免疫球蛋白Fab片段二抗多标免疫组化实验时一抗种属来源相同根据protocol使用Fab片段二抗来完成多标实验Fab片段二抗在孵育前先对一抗进行免疫标记FabuLight™内源性酶使用过氧化物封闭内源性过氧化酶过氧化物使用levamisole封闭内源性磷酸酶levamisole内源性生物素封闭内源性生物素使用streptavidin（链霉亲和素）孵育，以消除内源性生物素离子作用或疏水作用在缓冲液中加入合适的试剂，优化盐浓度和pH值Tween 20 或/和Triton X-100免疫试剂上文中提到的能够帮助解决实验里出现的问题的免疫试剂介绍如下：❖标准血清（Normal Serums）标准血清来自未产生免疫反应的动物，因此不会检测到任何特异性抗原。在PBS(或类似的缓冲液)中稀释到5% (v/v)的标准血清被强烈推荐作为阻断剂，以减少非特异性、保守序列和/或fc受体结合的背景。最好的结果是使用稀释的来自同一宿主的正常血清作为标记抗体，在加入一抗之前作为单独的孵育步骤。❖从标准血清中提取的ChromPure™纯化蛋白（ChromPure™ Purified Proteins from Normal Serums）ChromPure™蛋白主要用作一抗或二抗的实验对照。它们也可用作Western blotting, IHC和IF的阻断试剂。ChromPure™蛋白来源于未免疫动物的血清，不识别任何已知的抗原。它们是使用各种色谱技术制备的，以产生无污染分子观察到的浓度高达20 mg/ml的材料，使它们成为最敏感的测定的实验对照的理想选择。ChromPure™蛋白可用于许多物种的各种格式，包括全免疫球蛋白，F(ab’)2和Fab片段。人IgM、血清IgA和其他蛋白质也可用。Jackson为该产品线提供了广泛的偶联物，包括一系列荧光染料和示踪酶，允许从非特异性相互作用中分辨出信号。❖单价Fab片段亲和纯化抗体亲和纯化抗体fab片段可用于阻断内源性免疫球蛋白以减少背景染色和双标记来自同一宿主物种的主抗体。下面的例子展示了在小鼠组织上使用小鼠一抗时，如何使用Fab片段阻断内源性免疫球蛋白。❖牛血清蛋白（无IgG，无蛋白酶）牛血清白蛋白(BSA)被广泛用作稀释抗体的载体蛋白，并在免疫测定和免疫检测方案中作为一种常用的蛋白质阻断剂。如果牛血清蛋白是您的试验所需的稀释剂或阻断剂，那么使用适合此目的的牛血清蛋白是很重要的。牛IgG与山羊、绵羊和马的IgG有许多共同的表位，可以成为针对这些物种的二抗的靶点(牛抗山羊IgG除外)。这也可能发生在与牛IgG有交叉反应的其他抗体上。这些相互作用可能导致抗体活性的损失和/或背景增加。这些背景的产生可能来自于粘稠可溶性免疫复合物，或来自于因牛IgG蛋白的污染而产生的非特异性交叉反应。更多推荐：编辑于 2022-09-22 08:56ELISAwb实验赞同 1添加评论分享喜欢收藏申请

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