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2024-03-07 17:43:41
CCK-8检测细胞增殖/毒性的原理、方法及注意事项 - 知乎
CCK-8检测细胞增殖/毒性的原理、方法及注意事项 - 知乎切换模式写文章登录/注册CCK-8检测细胞增殖/毒性的原理、方法及注意事项药学科研崽南京大学博士、中国药科大学硕，药学问题可付费询问，详细答疑！前言 科研中的我们，细胞毒性试验是必备的，实验中常遇见各种细节问题，例如细胞数量的不统一或者0加药组与对照组未加适量的有机溶剂（常为DMSO，给药组溶剂），因此会导致出现不同的结果，当然很多同学在做cck8时候会用到大于10%的DMSO，那么需要注意的问题就来了，药学科研崽子来分享一下注意事项吧。 Cell Counting Kit-8（简称CCK-8）是一种基于WST-8的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的检测试剂。WST-8【化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】，是一种类似于MTT的化合物，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）存在的情况下，被线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的橙黄色甲瓒产物（formazan）。细胞增殖越多越快，颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅，对于同样的细胞，颜色的深浅与活细胞的数量成正比，因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。机理图图1. CCK-8检测原理图CCK-8的优点产生的甲瓒产物是水溶性的，无需换液，适合悬浮细胞不需要放射性同位素和有机溶剂，对细胞的毒性小CCK-8细胞活性检测试剂毋需预制，即开即用灵敏度高，线性范围宽，数据可靠，重现性好操作简便，省时省力适合于高通量药物筛选CCK-8的缺点：与MTT法相比，CCK-8的价格比较贵CCK-8试剂的颜色为淡红色，与含酚红的培养基颜色接近，操作过程中容易漏加或多加实验一：细胞增殖分析1）制备细胞悬液，计数。2）在96孔板中接种细胞悬液，每孔约100μl，同样的样本可做3个重复。3）将培养板放入培养箱中预培养一段时间（37℃, 5%CO2），细胞贴壁需要大约2-4h，如果是悬浮细胞，该步骤可以省去。4）每孔各加入10μl CCK-8溶液，由于加入的CCK-8量比较少，可能会因试剂沾在孔壁上而带来误差，建议在加完试剂后轻轻晃动培养板以帮助混匀，或者直接配置含10%CCK-8的培养基，以换液的形式加入。另外注意，加样的过程中尽量不要产生气泡。5）将培养板放入培养箱中孵育1-4h。因为细胞种类不同，形成的formazan的量也不一样，所以如果显色不够的话，可以延长培养时间，特别是血液细胞形成的formazan很少，需要较长的显色时间（5-6h）。6）酶标仪测定450nm处的吸光值（OD）。7）若暂时不测定OD值，可以在各孔中加入10μl 0.1 M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，室温下避光保存，这样可以保证OD值在24h内不发生变化。实验二：细胞毒性分析1）制备细胞悬液，计数。2）在96孔板中接种细胞悬液，每孔约100μl，同样的样本可做3个重复。3）将培养板放入培养箱中预培养一段时间（37℃, 5%CO2），细胞贴壁需要大约2-4h，如果是悬浮细胞，该步骤可以省去。4）向培养板各孔中加入不同浓度的毒性物质（药物、化学试剂等待检测物质）。5）将培养板放入培养箱中孵育一段时间，例如6、12、24、48h，具体时间要看待测物质的性质和细胞的敏感性。如果待检测物质有氧化性或还原性，可在加入CCK-8之前更换新鲜培养基，以去掉待测物质的影响。如果影响比较小或者没有影响，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。6）向每孔中加入10μl CCK-8溶液，由于加入的CCK-8量比较少，可能会因试剂沾在孔壁上而带来误差，建议在加完试剂后轻轻晃动培养板以帮助混匀，或者直接配置含10%CCK-8的培养基，以换液的形式加入。另外注意，加样的过程中尽量不要产生气泡，以免影响OD值读数。7）将培养板放入培养箱中孵育1-4h。因为细胞种类不同，形成的formazan的量也不一样，所以如果显色不够的话，可以延长培养时间，特别是血液细胞形成的formazan很少，需要较长的显色时间（5-6h）。8）用酶标仪测定450nm处的吸光度（OD）。9）若暂时不测定OD值，可以在各孔中加入10μl 0.1 M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，室温避光保存，这样可以保证OD值24h内不发生变化。活力计算：细胞活力（%）=[A(加药)-A(空白)]/[A(0加药)-A(空白)] ×100A（加药）：具有细胞、CCK-8溶液和药物溶液的孔的OD值A（0加药）：具有细胞、CCK-8溶液而没有药物溶液的孔的OD值A（空白）：没有细胞的孔的OD值细胞活力：细胞增殖活力或细胞毒性活力注意事项：1. 第一次做实验时，建议先做几个孔摸索接种细胞的数量和加入 CCK-8 试剂后的培养时间。2. 接种时注意细胞悬液一定要混匀，以避免细胞沉淀下来，导致每孔中的细胞数量不一致。3. 培养板周围一圈孔培养液容易挥发，为减少误差，建议培养板周围的四边每孔只加培养基。4. 建议采用多通道移液器，减少平行孔间的误差，加 CCK-8 时，建议斜贴着培养板壁加，不要插到培养基液面下加，容易产生气泡，干扰 OD 值。5. 若细胞培养时间较长，培养基颜色或 pH 发生变化，建议更换培养基后再加 CCK-8，含有酚红的培养基不影响测定。6. CCK-8 对细胞的毒性非常低，其他的实验，例如中性红法或结晶紫法 ，也可在 CCK-8 法检测完后继续进行。7. 可以使用大于 600 nm 的波长，例如 650 nm，作为参考波长进行双波长测定，CCK-8 在参比波长处没有吸光值，设定参比波长的目的是为了去除由于样品浑浊所带来的吸收。8. 如果实验中待测物质有氧化还原剂，在不含细胞的培养基中加入药物，然后加入 CCK-8 试剂在一定时间内检测，和不加药物的培养基进行比较 （只加 CCK-8 试剂），如果 OD 值明显偏高，则说明有反应。9. 加 CCK-8 试剂时速度要快，减少试剂在移液器上的残留，加入 CCK-8 试剂后轻轻震培养板，为了避免加样时由于 CCK-8 残留在枪头上所带来的误差，可以在加样前用培养稀释 CCK-8 试剂并混匀后加样。10. CCK-8 反复冻融会增加背景值，干扰实验测定。11.接种细胞数：针对标准96孔板，贴壁细胞的最小接种量为1000个/孔 (100μl培养基)。若为白细胞，接种量不低于2500个/孔 (100μl培养基)。如若使用24孔板或6孔板，应预先计算每孔相应的接种量，并按照每孔培养基总体积的10%加入CCK-8溶液。11.CCK-8 反应时间：悬浮细胞与贴壁细胞相比较难显色，因此需要增加细胞数量并延长CCK-8反应时间。另外，在培养箱中孵育期间，培养板最外一圈的孔最容易干燥挥发，造成体积不准确，从而增加误差，因此，建议最外一圈的孔只加培养基，不作为测定孔用。另外，如果细胞培养时间较长导致培养基颜色发生了变化，应洗涤细胞更换培养基后再加CCK-8进行检测。12.空白对照：在不含细胞的培养基中加入CCK-8，测定450nm的吸光度即为空白对照。在细胞毒性实验中，还应考虑药物的吸收，可在加入药物的培养基中加入CCK-8，测定450nm的吸光度作为空白对照。13.测定波长：如果样品为高浑浊度的细胞悬液，建议采用双波长进行测定，检测波长450-490nm，参比波长600-650nm。13.如果待测物质有氧化还原性，可在加 CCK-8 之前更换新鲜的培养基，去掉待测物质的影响。☆ 计算公式：细胞存活率 = [（实验孔 — 空白孔）/ （对照孔 — 空白孔）] × 100%抑制率 = [（对照孔 — 实验孔） / （对照孔 — 空白孔）] × 100%实验孔 （含有细胞的培养基、CCK-8、待测物质）对照孔 （含有细胞的培养基、CCK-8、没有待测物质）空白孔 （不含细胞和待测物质的培养基、CCK-8）CCK-8 常见问题解答☆ CCK 的保存和稳定性如何？答：CCK 稳定性高，避光条件 -20℃ 有效期 2 年，4℃ 有效期 1 年。经常使用建议 4℃ 保存，避免反复冻融。CCK 正常颜色为粉红色，若颜色发生明显偏差，质量可能有发生变化。☆ CCK 会对活细胞进行染色吗？答：不会，首先 WST-8 不会进入细胞染色，整个显色反应都是在培养体系中进行的。另外 WST 和 WST-8 甲臜都属于高度水溶性组分，反应结束更换新的培养液，即可清除外源组分。☆在加入 CCK-8 时可否不更换培养基？答：一般情况下可以不更换培养基。但是如果培养基里有氧化还原性物质的话，有可能会产生误差，必须更换其它培养基。☆ 若是使用 6 孔或者 24 孔板进行试验，CCK 试剂使用量怎么样呢？答：如果要使用 6 孔板或 24 孔板实验，请先计算每孔相应的接种量，并按照每孔培养基总体积的 10% 加入 CCK 溶液。☆ 能否用 384 孔板进行细胞增殖与活性检测的实验呢？答：可以，CCK-8 产品的使用量为每孔培养基总体积的 10%。建议先将 CCK-8 产品稀释一倍，然后加入培养基总体积的 20% 即可，这样可减少误差。☆ 只可以在 450 nm 波长处测 OD 值吗？答：可以在 450 nm 波长处测 OD 值，但是若无此波长的滤光片，可选择吸光度在 430~490 nm 之间的滤光片，但是 450 nm 滤光片的检测灵敏度最高。☆ 若是暂不检测 OD 值，该如何处理？答：若暂时不测定 OD 值，可以向每孔中加入 10μL0.1 M 的 HCl 溶液或者 1% w/v SDS 溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24 小时内测定，吸光度不会发生变化☆ 在实验中 OD 值太高，怎么解决？答：可以缩短加入 CCK-8 后的培养时间。例如：可以把加入 CCK-8 试剂后的培养时间由 2 小时缩短为 1 小时。此外，可适当减少细胞的数量。☆ 如果 OD 值太低，怎么解决？答：可以采取 2 个办法：1、适当增加细胞数量；2、延长加入 CCK-8 试剂后的反应时间。☆ 应该每次做标准曲线吗？答：建议每次做。虽然细胞是一样的，但是细胞的状态不一定一样。对于状态不一样的细胞，建议每次做标准曲线。祝大家科研顺利，欢迎补充！多年 CCK-8 经验总结请收好，这些坑不要再跳了 - 实验方法 - 丁香通 (biomart.cn)CCK-8检测细胞增殖/毒性的原理、方法及注意事项 - 安必奇生物 (abace-biology.com)发布于 2022-03-17 10:24癌症生物学分子生物学细胞生物学赞同 1095 条评论分享喜欢收藏申请
胆囊收缩素_百度百科
素_百度百科 网页新闻贴吧知道网盘图片视频地图文库资讯采购百科百度首页登录注册进入词条全站搜索帮助首页秒懂百科特色百科知识专题加入百科百科团队权威合作下载百科APP个人中心胆囊收缩素播报讨论上传视频多肽激素收藏查看我的收藏0有用+10胆囊收缩素（cholecystokinin），多肽激素。由33个氨基酸组成。全部生物活性存在于c端的八肽片段。最初从动物的上段肠中提取，以后发现大脑皮层、海马、杏仁核、下丘脑等部位均存在。其外周作用已比较清楚，可刺激胃分泌胃酸，肝脏分泌胆汁，抑制回肠吸收钠和水，刺激胰岛释放胰岛素和胰高血糖素。其中枢作用还不很明确，有资料显示，它与摄食行为有关，与肥胖症也有关。还参与痛觉调节。 [1]中文名胆囊收缩素外文名cholecystokinin别 名缩胆囊素缩 写CCK目录1药理毒理2背景介绍3名词解释4原理药理毒理播报编辑胆囊收缩素（cholecystokinin，CCK，PZ）于1928年、1943年被证明并提纯。天然CCK化学结构有多种，有CCK-33，CCK-39，CCK-58，以及从山羊和人小脑中分离出一种8肽CCK等。含CCK的细胞存在于哺乳动物十二指肠和空肠粘膜，其细胞与人肠I细胞同。1978年有人发现，CCK还存在于中枢神经系统，且含量大于小肠内含量，存在于皮层额叶、皮层梨状区、尾核、海马、丘脑、下丘脑、小脑和间脑。CCK在血中很快降解，其半衰期约3分钟。具多种生物作用，主要为刺激胰酶分泌与合成，增强胰碳酸氢盐分泌，刺激胆囊收缩与奥狄氏括约肌松弛，还可兴奋肝胆汁分泌，调节小肠、结肠运动，也可作为饱感因素调节摄食。背景介绍播报编辑发表在2004年1月号美国《AJP - Gastrointestinal and Liver Physiology》(美国胃肠与肝生理学杂志)上的一项研究表明，胆囊收缩素在调节协调胃肠活动方面起作用，是进食量控制的重要介质。约翰霍普金斯学医学院的Moran TH博士指出，在进餐时，摄入的营养物质在胃内聚集，并逐渐进入小肠。摄入的营养物质会引起一系列的生理反应，从而促进总的消化过程进行。研究人员指出，在进食过程中，会释放各种神经肽和神经递质，进一步协调胃肠道分泌和运动，最终导致饱腹感和停止进食。其中胆囊收缩素是一种脑/肠激素，食物摄入促进其分泌。Moran博士认为，胆囊收缩素在调节协调胃肠活动方面起多种作用，是进食量控制的重要介质。名词解释播报编辑胆囊收缩素（CCK）是由小肠粘膜I细胞释放的一种肽类激素。其主要作用是促进胰腺腺泡分泌各种消化酶，促胆囊收缩，排出胆汁，对水和HCO3-的促分泌作用较弱。CCK还可作用于迷走神经传入纤维，通过迷走——迷走反射刺激胰酶分泌。CCK通过激活磷脂酰基醇系统，在Ca2+介导下对胰腺起作用。CCK与胰泌素具有协同作用。进食后，蛋白质水解产物可刺激小肠粘膜释放一种胆囊收缩素释放肽，刺激小肠粘膜I细胞分泌CCK。引起CCK分泌的因子由强到弱为：蛋白质分解产物、脂肪酸盐、HCl、脂肪，糖没有作用。此外，胰岛素能够增强胆囊收缩素的促淀粉酶分泌效应。小肠粘膜分泌胆囊收缩素释放肽对胰蛋白酶十分敏感，胰蛋白酶可使CCK释放肽失活，因此在CCK释放肽引起CCK释放和胰酶分泌增加之后，胰蛋白酶又会使其失去活性，从而反馈性的抑制了CCK和胰酶的进一步分泌。胰酶分泌的反馈性调节的生理意义在于能够防止胰酶分泌过量。我把胃泌素、胰泌素、胆囊收缩素的相互作用及在消化中的作用总结成下表：减少胰蛋白酶的分泌，也就是说在饮食上减少吃，由牛、羊、猪的内脏和部分干果和蔬菜。这也是为什么喜欢吃动物内脏和干果的人越吃越想吃。原理播报编辑通过特效食物和身体内的各种酶的复合作用，帮助分解出蛋白质分解产物、脂肪酸盐、HCl等刺激CCK（胆囊收缩素）分泌的分解因子，刺激下丘脑内侧，产生大量的饱腹信号。CCK在血中很容易被降解，以失去活性，其半衰期约3分钟。这时需要抑制胰蛋白酶的分泌，并持续的分解CCK分解因子刺激CCK的分泌，让饱腹信号持续刺激小丘脑。并作用于摄食中枢(Feeding Center)神经抑制食欲的产生。新手上路成长任务编辑入门编辑规则本人编辑我有疑问内容质疑在线客服官方贴吧意见反馈投诉建议举报不良信息未通过词条申诉投诉侵权信息封禁查询与解封©2024 Baidu 使用百度前必读 | 百科协议 | 隐私政策 | 百度百科合作平台 | 京ICP证030173号 京公网安备110000020000CCK-8实验——原理、步骤、注意事项、示例图 - 知乎
CCK-8实验——原理、步骤、注意事项、示例图 - 知乎首发于指北针的药学实验笔记切换模式写文章登录/注册CCK-8实验——原理、步骤、注意事项、示例图指北针天津大学 药学硕士一、实验应用1. 细胞增殖测定2. 细胞毒性测定3. 细胞活性测定 (不加样本，没有下述DAY 2步骤2)4. 药物筛选5. 肿瘤药敏试验6. 微生物对细胞毒性或增殖的测定二、实验原理CCK8全称Cell Counting Kit-8试剂，可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析。其基本原理为：该试剂中含有水溶性的四唑盐WST-8[化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐]，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯(1-Methoxy PMS)的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物(Formazan dye)。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。CCK-8检测原理三、仪器和试剂1. 仪器：台式离心机、细胞计数仪、CO2培养箱、倒置显微镜、酶标仪(450nm滤光片)、10μL，100-200μL多通道移液器等。2. 试剂：CCK8检测试剂盒、DMEM或其他培养基、双抗、FBS、PBS、DMSO。四、实验步骤DAY 11. 对前一天培养好的细胞消化、离心、计数。2. 在96孔板上接种100μL 3k-7k/孔的细胞，在37℃、5% CO2、90%湿度条件下培养24小时。DAY 21. 在显微镜下观察细胞生长状态和密度，取生长状态良好，细胞分布及密度均一的孔进行实验。2. 配制不同浓度梯度的样本溶液，如300、100、33.3、11.1、3.7、1.2、0.4、0.14uM。每个浓度三个复孔加入到96孔板中，在37℃、5% CO2、90%湿度条件下培养适当时间长度。如6，12，24或48小时。DAY 3/41. CCK8使用前在室温下解冻并离心。2. 用倒置显微镜检测细胞生长状态，并用4X/10X取生长状态良好，细胞分布及密度均一的孔拍照记录。3. 在每孔中加入10μL的CCK-8溶液。4. 在37℃、5% CO2、90%湿度条件下培养0.5-4小时。5. 用酶标仪在450 nm处测量吸光度。6. 用Excel及Graphpad Prism处理并分析结果。7. 结果示例图：Bao K, Cell Death Dis.2021;12(4):380.Pu X, Cell Death Dis. 2021;12(3):256. 五、注意事项1. 第一次做实验时，建议先做几个孔摸索接种细胞的数量和细胞达到实验要求的培养时间，这是因为不同的细胞生长速度不同。2. 接种时细胞悬液一定要混匀，以避免细胞沉淀下来，导致每孔中的细胞数量不一致，最好一人接种，一人辅助混匀。3. 培养板周围一圈孔培养液容易挥发，为减少误差，建议培养板周围的四边每孔只加培养基、PBS或水。4. 药物样本初筛时可以适当减少浓度梯度的数量，增大浓度梯度间的倍数。若要确定样本的IC50则需要增加浓度梯度的数量，一般8-12个足矣。若有文献参考，则根据文献设置浓度梯度。5. 加入样本时要注意培养基中血清浓度对样本的影响，部分样本可能受血清影响较大，此时需使用无血清培养基培养细胞。6. 加样本前，要先吸出前面的培养基，但不可长期搁置防止细胞死亡，最好一块板吸完，立即加入配好的不同浓度的样本。7. 若样本有氧化性或还原性，可在加入CCK-8之前更换新鲜培养基，去掉待测药物的影响。当样本影响比较小的情况下可以不更换培养基。8. 拍照时若有沉淀、结晶或较脏，要用PBS洗一遍，加培养基后再加CCK8。9. 加CCK-8时，建议斜贴着培养板壁加，不要插到培养基液面下加，容易产生气泡，干扰OD值。加CCK-8试剂时速度要快，减少试剂在移液器上的残留，加入CCK-8试剂后轻轻震培养板，为了避免加样时由于CCK-8 残留在枪头或壁上上所带来的误差。10. CCK-8反复冻融会增加背景值，干扰实验测定。11. 设置实验孔 (含有细胞的培养基、CCK-8、待测物质)阴性对照孔 (含有细胞的培养基、CCK-8、不含待测物质)阳性对照孔 (含有细胞的培养基、CCK-8、阳性对照样本)空白孔 (不含细胞和待测物质的培养基、CCK-8)12. 实验结果计算公式：细胞存活率=[(实验孔-空白孔)/(阴性对照孔-空白孔)]×100%抑制率=[(阴性对照孔-实验孔)/(阴性对照孔-空白孔)]×100%六、参考文献[1] Bao K, Li Y, Wei J, et al. Fangchinoline suppresses conjunctival melanoma by directly binding FUBP2 and inhibiting the homologous recombination pathway. Cell Death Dis. 2021;12(4):380. Published 2021 Apr 7. doi:10.1038/s41419-021-03653-4[2] Pu X, Ye Q, Cai J, et al. Typing FGFR2 translocation determines the response to targeted therapy of intrahepatic cholangiocarcinomas. Cell Death Dis. 2021;12(3):256. Published 2021 Mar 11.doi:10.1038/s41419-021-03548-4声明：本本章重在分享科研方法、资讯、传播知识。文章不构成任何投资建议，也非临床预防、诊断、治疗建议。未经许可严禁商业性转载，非商业性转载请注明出处。编辑于 2023-11-02 18:00・IP 属地广东细胞生物实验药学赞同 9817 条评论分享喜欢收藏申请转载文章被以下专栏收录指北针的药学实验笔记专注药学领域，生物药、化药药效学评价
CCK8实验原理、步骤与优势大盘点，这些你都了解吗？ - 知乎
CCK8实验原理、步骤与优势大盘点，这些你都了解吗？ - 知乎切换模式写文章登录/注册CCK8实验原理、步骤与优势大盘点，这些你都了解吗？非知名研究僧科研服务老兵实验是简单的，道路是曲折的，时间就是用来浪费的，科研就是自娱自乐使劲折腾。我也很努力很认真啊，为啥效率总提不起来呢？其实，有时候并不是自己不努力，只是没有找对方法。做实验可不能光是埋头苦干，还要学会运用合适的检测试剂盒，这样就能事半功倍。如果你还在用 MTT，那就真的 OUT 了，MTT 花 4 小时才能得到的结果用 CCK-8 只需 1 小时，CCK-8 可用于细胞增殖和毒性分析，同 MTT 法相比，CCK-8 即开即用，检测时间大概在 1 小时左右。CCK8是什么CCK-8的英文全称是Cell Counting Kit-8，也就是进行细胞计数的一个盒子。那它的用途也就大致可以猜到，和细胞增殖、细胞毒性相关的实验都可以。CCK8的原理在CCK-8试剂盒中，最主要的化学药品是WST-8，化学名为2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐。它的核心基团和MTT是一样的，是MTT的升级版本。在电子耦合试剂（也就是细胞是活的，有呼吸，有能量代谢）存在的情况下，可被NAD+氧化还原成为水溶性的黄色甲瓒产物(Formazan)。活细胞越多，产生的Formazan就越多，颜色也会越深。WST-8 检测原理图 EC=electron coupling reagent，即电子耦合试剂所以粗略的可以认为生成的甲瓒物的颜色的深浅与活细胞的数量成正比。为什么是粗略的呢，因为这里没有考虑到细胞代谢水平的高低，有些细胞在药物处理后，可能活细胞数不变，但是代谢率低了以后，细胞呼吸减弱，NAD+产生减少，测出的Formazan也会减少。CCK-8 检测细胞活性原理图CCK8的用途1.细胞增殖测定：细胞增殖实验在很多领域都会用到，比如肿瘤相关、损伤后修复等。2.药物筛选：在测定一个药物的毒性和安全有效浓度时，经常会用到CCK-8。3.细胞毒性测定：这个可以和各个处理因素对细胞活性和增殖的影响，比如在UV、低氧或者什么化学物品对细胞的影响上。4.肿瘤药敏试验：这个是用的比较广的，我见过做肿瘤的团队，买CCK-8都是一整箱，一整箱的买。5.微生物对细胞的毒性或增殖的实验。CCK方法的优势CCK法与其他细胞增殖/毒性检测方法的优势比较优点：1.酚红和血清对CCK法的检测不会造成干扰；2.细胞毒性非常低，因此加入WST-8显色后，可以在不同时间反复用酶标仪读数从而找到最佳测定时间。CCK法的操作步骤（更多内容请见说明书）：实验一：细胞活性检测1、在96孔板中接种细胞悬液（100μL/孔）。将培养板放在培养箱中预培养（37℃,5% CO2）。2、向每孔加入10 μL CCK溶液（注意不要在孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数）。3、将培养板在培养箱内孵育1-4小时。4、用酶标仪测定在450nm处的吸光度。5、若暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24小时内测定，吸光度不会发生变化。实验二：细胞增殖-毒性检测1、在96孔板中配置100μL的细胞悬液。将培养板在培养箱预培养24小时（37℃，5% CO2）。2、向培养板加入10μL不同浓度的待测物质。3、将培养板在培养箱孵育一段适当的时间（例如：6、12、24或48小时）。4、向每孔加入10μL CCK溶液（注意不要再孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数）。5、将培养板在培养箱内孵育1-4小时。6、用酶标仪测定在450nm处的吸光度。7、若暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24小时内测定，吸光度不会发生变化。注意：如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK之前更换新鲜培养基（除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基），去掉药物影响。当然药物影响比较小的情况下，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。细胞因子检测、分子生物学、细胞生物学、免疫学，论文基金申请写作，SCI润色。可V.X联系：potterlee编辑于 2023-10-18 18:57・IP 属地北京生物技术细胞生物学科研课题赞同 22617 条评论分享喜欢收藏申请
胆囊收缩素 - 医学百科
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胆囊收缩素来自医学百科名字空间页面讨论更多更多语言页面选项Read查看源代码历史胆囊收缩素（cholecystokinin，CCK，PZ）
从猪小肠提取物中分离出来的、由33个氨基酸组成的多肽。具刺激胆囊收缩和兴奋胰酶分泌的作用。于1928年、1943年被证明并提纯。天然CCK化学结构有多种，有CCK-33，CCK-39，CCK-58，以及从山羊和人小脑中分离出一种8肽CCK等。含CCK的细胞存在于哺乳动物十二指肠和空肠粘膜，其细胞与人肠I细胞同。1978年有人发现，CCK还存在于中枢神经系统，且含量大于小肠内含量，存在于皮层额叶、皮层梨状区、尾核、海马、丘脑、下丘脑、小脑和间脑。CCK在血中很快降解，其半衰期约3分钟。具多种生物作用，主要为刺激胰酶分泌与合成，增强胰碳酸氢盐分泌和胃排空，刺激胆囊收缩与奥狄氏括约肌松弛，还可兴奋肝胆汁分泌，调节小肠、结肠运动，也可作为饱感因素调节摄食。
背景介绍
1978年研究发现，CCK能存在于中枢神经系统，且含量大于小肠内含量，存在于皮层额叶、皮层梨状区、尾核、海马、丘脑、下丘脑、小脑和间脑。CCK在血中很快降解，其半衰期约3分钟。（即说明需要不断的分泌）具多种生物作用，主要为刺激胰酶分泌与合成，增强胰碳酸氢盐分泌和胃排空，刺激胆囊收缩与奥狄氏括约肌松弛，还可兴奋肝胆汁分泌，调节小肠、结肠运动，可作为饱感因素调节摄食。
发表在今年2004年1月号美国《AJP - Gastrointestinal and Liver Physiology》(美国胃肠与肝生理学杂志)上的一项研究表明，胆囊收缩素在调节协调胃肠活动方面起作用，是进食量控制的重要介质。
约翰霍普金斯学医学院的Moran TH博士指出，在进餐时，摄入的营养物质在胃内聚集，并逐渐进入小肠。摄入的营养物质会引起一系列的生理反应，从而促进总的消化过程进行。
研究人员指出，在进食过程中，会释放各种神经肽和神经递质，进一步协调胃肠道分泌和运动，最终导致饱腹感和停止进食。其中胆囊收缩素是一种脑/肠激素，食物摄入促进其分泌。
Moran博士认，胆囊收缩素在调节协调胃肠活动方面起多种作用，是进食量控制的重要介质。
（柠檬减肥网编译国外最新医学新闻）
名词解释：
胆囊收缩素（CCK）是由小肠粘膜I细胞释放的一种肽类激素。其主要作用是促进胰腺腺泡分泌各种消化酶，促胆囊收缩，排出胆汁，对水和HCO3-的促分泌作用较弱。CCK还可作用于迷走神经传入纤维，通过迷走——迷走反射刺激胰酶分泌。CCK通过激活磷脂酰基醇系统，在Ca2+介导下对胰腺起作用。CCK与胰泌素具有协同作用。
进食后，蛋白质水解产物可刺激小肠粘膜释放一种胆囊收缩素释放肽，刺激小肠粘膜I细胞分泌CCK。引起CCK分泌的因子由强到弱为：蛋白质分解产物、脂肪酸盐、HCl、脂肪，糖没有作用。此外，胰岛素能够增强胆囊收缩素的促淀粉酶分泌效应。
小肠粘膜分泌胆囊收缩素释放肽对胰蛋白酶十分敏感，胰蛋白酶可使CCK释放肽失活，因此在CCK释放肽引起CCK释放和胰酶分泌增加之后，胰蛋白酶又会使其失去活性，从而反馈性的抑制了CCK和胰酶的进一步分泌。胰酶分泌的反馈性调节的生理意义在于能够防止胰酶分泌过量。我把胃泌素、胰泌素、胆囊收缩素的相互作用及在消化中的作用总结成下表：
减少胰蛋白酶的分泌，也就是说在饮食上减少吃，由牛、羊、猪的内脏和部分干果和蔬菜。这也是为什么喜欢吃动物内脏和干果的人越吃越想吃。
原理：
通过特效食物和身体内的各种酶的复合作用，帮助分解出蛋白质分解产物、脂肪酸盐、HCl等刺激CCK（胆囊收缩素）分泌的分解因子，刺激下丘脑内侧，产生大量的饱腹信号。
CCK在血中很容易被降解，以失去活性，其半衰期约3分钟。这时需要抑制胰蛋白酶的分泌，并持续的分解CCK分解因子刺激CCK的分泌，让饱腹信号持续刺激小丘脑。并作用于摄食中枢(Feeding Center)神经抑制食欲的产生。
取自“https://www.yixue.com/index.php?title=胆囊收缩素&oldid=128122”
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细胞增殖和细胞毒性（CCK-8法）原理和经验总结-丁香实验
和细胞毒性（CCK-8法）原理和经验总结-丁香实验48小时，有问必答丁香实验，轻松科研已收录 10000+ 实验48小时，有问必答丁香实验，轻松科研已收录 10000+ 实验48小时，有问必答登录提问提问我要登录｜免费注册丁香通首页|细胞增殖和细胞毒性（CCK-8法）原理和经验总结点赞收藏分享细胞增殖和细胞毒性（CCK-8法）原理和经验总结Elabscience2022-10-3115231一、实验原理细胞活力检测试剂盒(CCK-8) 可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析。
其基本原理为：该试剂中含有WST-8【化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】，在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物（Formazan dye）。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。CCK-8法是用于测定细胞增殖或毒性实验中活细胞数目的一种高灵敏度，无放射性的比色检测法,可替代传统的MTT法。
二、用途
药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验等。
三、优点
使用方便，无需洗涤细胞，不需要放射性同位素和有机溶剂；
CCK-8法能快速检测；
CCK-8法的检测灵敏度很高，甚至可以测定较低细胞密度；
CCK-8法的重复性优于MTT 法，产生的formazan 是水溶性的，减少因洗涤和溶解带来的误差；
CCK-8法对细胞毒性小，可以多次测定选取最佳测定时间，与MTT 方法相比线性范围更宽，灵敏度更高；
CCK-8细胞活性检测试剂无需预制，即开即用。
四、实验操作指南
1．96孔板每孔加入细胞100 μL（留2个空白组不加细胞，加入同体积的培养基）。细胞置于37°C的5%CO2细胞培养箱中培养24 h。
注：A、通常细胞增殖实验每孔加入100 μL约含2000个细胞，细胞毒性实验每孔加入100 μL约含5000～10000个细胞（具体每孔所用的细胞的数目，需根据细胞的大小，细胞增殖速度的快慢等决定）。
B、培养温度与细胞类型有关，一般哺乳动物细胞建议37°C，其他种属根据细胞培养条件选择合适的温度。
2．每孔加入10 μL不同浓度的药物刺激激（1 中加了细胞的，留 2 个对照组不加药物，加 入同体积的培养基）。
3．将96孔板在37°C，含5% CO2空气及100%湿度的细胞培养箱中孵育适当时间。
注：同上。根据不同实验细胞需求选择适当的孵育条件和时间。
4．每孔加入10 μL的CCK-8溶液。37°C，5%CO2培养箱中孵育1~4 h。
注：同上。根据不同实验细胞需求选择适当的孵育条件和时间。
5．酶标仪测定450 nm处的吸光度。
6．如果暂时不测定OD值，可向每孔中加入10 μL 0.1 M HCl溶液或者1%（W/V）SDS溶液，并遮盖培养板避光室温保存。在24小时内吸光度不会发生变化。
7．结果分析：
A．细胞存活率：将各测试孔的OD值减去本底OD值（空白组），各重复孔的OD值取平均数±SD。
细胞存活率% =(加药细胞OD/对照细胞OD)×100%。
B．求出T/C = 50% 时的药物浓度(IC50)及T/C = 10%时的药物浓度(IC90)。
五、经验总结
1．种板数：通过文献确认，看实验所用细胞别人是否做过，找出大致范围。稀释一系列浓度种板。
观察多长时间细胞可贴壁完全，一般贴壁生长24小时。在实验时间内，观察不同细胞数下孔内生长情况。在拟定的时间内，细胞是刚好铺满还是堆积生长？
因为每块板都需设置对照孔，也就是含有细胞的培养基中加入CCK8，这个数值是板上的最大数值，CCK8试验最佳OD值在1.0附近。不要让细胞长满，其一，会对药物顺利进入细胞产生影响此，其二生长不均匀易导致孔间OD值数据偏差大。
2．贴壁生长的时间一般设置贴壁24h，这个时间一般细胞已经贴壁完全，且对安排实验时间也方便。
3．加药后的孵育时间，设置时间梯度，根据数据的稳定性（RSD）、OD值的范围（1.0左右）这些来选择最好的时间。
4．接种时注意细胞悬液一定要混匀，以避免细胞沉淀下来，导致每孔中的细胞数量不等，可以每接种数孔即混匀一下。培养板周围一圈孔培养基容易挥发，为了减少误差，建议培养板的四边每孔只加培养基或无菌PBS，而不作为指标检测孔。
5．CCK8试剂加入量，按照说明书的体系加入合适的CCK-8的含量如细胞体系较大，适当增加CCK-8的量。
6．CCk8试剂加入后孵育时间，随着时间的增加，OD值就会增大。CCK- 8的最佳反应时间以具体显色的最佳时间为准。第一次做实验时，建议先做数孔摸索接种细胞的最佳数量和加入CCK-8试剂后的最佳孵育时间。一般情况下，白细胞较难显色，因此需要较长的CCK- 8反应时间或增加细胞数量 (～105个细胞/孔)。悬浮细胞与贴壁细胞相比较难显色。对于悬浮细胞，在加入CCK- 8孵育1- 4小时后，可先从培养箱中取出，目测染色程度或用酶标仪测定决定CCK- 8最佳孵育时间。若显色困难，可将培养板放回培养箱，继续培养数小时后再测定。对于贴壁细胞，CCK- 8的孵育时间一般为1- 4小时，多数细胞在培养30分钟左右即可肉眼观察到明显的显色反应，培养3.5-4小时左右检测效果最佳。总之原则就是把OD值控制在1.0左右。
7．实验时尽量多设置复孔，取平均值。实验时把OD值控制在1.0左右。因人为造成的数据不稳定只能通过增大样品数，借助数据处理来弥补。另外实验操作一定要仔细小心，尽量平行操作。
8．CCK-8的检测依赖于脱氢酶催化的反应，如果待检测体系中存在较多的还原剂，例如一些抗氧化剂会干扰检测，需设法去除。含有酚红的培养基不影响本试剂盒做细胞活性的测定。
9．如何判定待测溶液是否有还原性？不含细胞的待测溶液孔中加入CCK-8溶液10 μL，孵育1-4小时，测定在450 nm处的空白吸光度。如果该吸光度很小，说明待检测体系中存在较少的还原剂，正式检测时即可直接加入CCK-8 ；如果该吸光度相对较大，说明待检测体系中存在较多的还原剂，正式检测时则需要除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基和10 μL CCK-8进行检测。
10．如果样品为高浑浊度的细胞悬液，建议设定600 nm (或600 nm以上) 作为参比波长，扣除参比波长的O.D值即可。预览相关问答问F(ab')2刺激B细胞增殖原理是什么？71 围观2023-11-24问cck-8细胞毒性3 回答 395 围观2022-08-24问TUNEL 法的实验原理是什么？1 回答 2302 围观2013-03-01相关方法 细胞毒性分析（CCK-8 法）2023-03-03 细胞增殖分析（CCK-8 法）2023-03-03细胞增殖检测：MTT法2023-03-16推荐阅读多年 CCK-8 经验总结请收好，这些坑不要再跳了细胞增殖检测：MTT实验经验总结【交流】CCK-8替代MTT提问48 小时有问必答扫一扫实验小助手关注公众号反馈TOP打开
研究揭示缩胆囊素受体识别配体和G蛋白选择性的分子机制----中国科学院
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9月23号，中国科学院上海药物研究所研究员蒋轶/徐华强团队、赵强团队、吴蓓丽团队、王明伟/杨德华团队和上海科技大学研究员赵素文团队在Nature Chemical Biology上，背靠背在线发表了题为Ligand recognition and G protein-coupling promiscuity of cholecystokinin A receptor和Structures of the human cholecystokinin receptors bound to agonists and antagonists的两项研究成果，解析了2种小分子拮抗剂（Devazepide、Lintitript）和激动剂NN9056与A型人源缩胆囊素受体（Cholecystokinin receptor，CCKAR）结合的3个晶体结构，以及多肽激素CCK-8的CCKAR分别与3种不同G蛋白（Gs、Gi、Gq）偶联复合物和多肽Gastrin-17分别与B型缩胆囊素受体（CCKBR）和两种G蛋白（Gi、Gq）形成复合物的5个冷冻电镜结构。两项研究揭示了多种多肽和小分子配体特异性识别缩胆囊素受体亚型的结构基础，阐明了配体选择性和受体活化的分子机制，破解了CCKAR选择性偶联不同G蛋白的奥秘，从而为靶向该类受体的药物研发提供了重要信息。
缩胆囊素（Cholecystokinin, CCK）是胃肠激素之一。CCK和胃泌素（Gastrin）是酪氨酰磺酸化多肽家族成员，具有保守的羧基末端八肽序列。两者在胃肠道和中枢神经系统中含量丰富，通过与缩胆囊素受体结合发挥激素调节和神经递质的作用。缩胆囊素受体包括A和B两个亚型（CCKAR和CCKBR），属于A类G蛋白偶联受体（GPCR）。CCKAR特异性识别磺酸化的CCK，而CCKBR对磺酸化和非磺酸化的CCK和Gastrin均有较强亲和力。这两类CCK受体参与调控的生理功能包括饱腹感、胰酶分泌和胆囊收缩，并与焦虑、记忆和药物成瘾等相关，因而是肥胖症、2型糖尿病和焦虑症等疾病的潜在治疗靶标。高选择性CCKAR非肽类拮抗剂（如Devazepide和Lintitript）被开发用来治疗胃肠功能紊乱、神经性疼痛和胰腺癌等疾病，而其激动剂NN9056对肥胖症具有一定疗效。但由于低药效和生物利用度等问题，大多数靶向CCKR的候选药物终止于临床研究。因此，开展CCKR的结构与功能研究将深化对其配体识别机制的认识，助力相关新药的创制。
GPCR被配体激活后主要通过偶联细胞内的G蛋白进行信号转导。根据α亚基的不同，G蛋白可分为Gi/o、Gs、Gq/11和G12/13d等四亚家族。虽然目前已报道了不同GPCR与其下游G蛋白结合的大量复合物结构，但受体如何精确识别这四种G蛋白尚不清楚。由于CCKAR能够偶联这四种不同的G蛋白，因而成为研究GPCR与G蛋白选择性结合机制的模式受体。
第一项研究中，科研人员解析了磺酸化CCK-8激活的CCKAR与Gq、Gs和Gi蛋白偶联的复合物冷冻电镜结构，分辨率分别为2.9 埃、3.1 埃和3.2 埃（图1a）。结合结构分析和功能验证，该工作展示了内源多肽激素—磺酸化CCK-8（以下简称CCK-8）的结合模式：CCK-8的氨基末端由受体的三个胞外环（ECL）紧紧包裹，其羧基末端插入受体的正构口袋。科研人员还鉴定了识别CCK-8的关键氨基酸残基和磺酸化基团发挥CCK-8活性的关键位点：位于CCKAR上ECL2区域的R197与CCK-8第二位酪氨酸修饰的磺酸基通过盐键结合进而决定磺酸化多肽的高亲和力（图1b）。
此外，该研究也对CCKAR选择性偶联Gq、Gs和Gi的分子机理进行了阐述，并提出ICL3参与CCKAR与Gq偶联的新机制。科研人员发现，偶联三种不同G蛋白的受体呈现相似的激活构象，然而受体与不同G蛋白结合界面的面积显示Gq > Gs > Gi的趋势。与之一致，CCKAR与其主要下游信号蛋白Gq偶联时产生的最大的激活效应（Emax）显著高于Gs和Gi。上述结果支持Gq是CCKAR主要偶联的G蛋白类型，明确了接触面积在G蛋白选择性识别中的作用。该工作进一步证实了Gq、Gs和Gi蛋白α亚基α5螺旋的末端弯钩（Wavy hook）是CCKAR对G蛋白选择性的参与者（图1c）。在CCKAR与Gq的复合物中，科研人员还发现CCKAR胞内环ICL3的I296与Gαq亚基的一个疏水结合口袋结合，这是首次在GPCR结构中观测到ICL3与Gα亚基的相互作用方式（图1d）。相反，由于Gαs和Gαi与Gαq在该疏水口袋残基组成的差异，CCKAR的相应ICL3区域与Gs和Gi不存在该疏水作用，说明ICL3决定了G蛋白之选择性。
第二项研究中，科研人员解析了CCKAR与小分子拮抗剂Devazepide、Lintitript和激动剂NN9056结合的三个晶体结构，以及结合多肽Gastrin的CCKBR分别与Gi和Gqo偶联的两个复合物冷冻电镜结构（图2a-e）。该工作揭示出多肽和小分子拮抗剂识别CCKR的分子机制，发现ECL2是CCKAR和CCKBR选择性识别多肽配体的决定因素。ECL2上的H207与多肽中D2形成的氢键决定了CCKBR对CCK-8、CCK-8ns和Gastrin-17的高亲和力（图2f），而ECL2上的R197与多肽中Y7的磺酸基形成的盐键决定了CCK-8对CCCKAR的高选择性（图2g）。同时，科研人员还发现N3336.55和R3366.58在CCKAR识别Devazepide和Lintitript过程中发挥了关键作用，为后继选择性靶向药物的开发奠定了基础。
此外，科研人员通过比对CCKAR结合拮抗剂Devazepide的结构、CCKAR结合激动剂NN9056的结构以及CCKAR同时结合激动剂CCK-8ns和Gq蛋白的结构，结合分子动力学模拟实验，阐释了CCKAR逐步激活的过程。相对于拮抗剂，激动剂在结合口袋中结合更深（图2h），随后引起PIF和FxxCWxP保守基序的变化（图2i和2j），进而导致受体胞内部分发生TM6和TM5向外以及TM7向内移动的激活态构象变化，从而揭示了CCKAR逐步激活的分子机制。
研究工作得到国家重点研发计划、国家卫健委科技重大专项、国家自然科学基金委、中科院战略性先导科技专项和上海市科技重大专项等的资助。
论文链接：1、2
图1.内源多肽CCK-8活化的CCKAR与和不同G蛋白偶联的冷冻电镜结构
图2.CCKR分别与小分子拮抗剂和多肽激动剂结合的三维结构
9月23号，中国科学院上海药物研究所研究员蒋轶/徐华强团队、赵强团队、吴蓓丽团队、王明伟/杨德华团队和上海科技大学研究员赵素文团队在Nature Chemical Biology上，背靠背在线发表了题为Ligand recognition and G protein-coupling promiscuity of cholecystokinin A receptor和Structures of the human cholecystokinin receptors bound to agonists and antagonists的两项研究成果，解析了2种小分子拮抗剂（Devazepide、Lintitript）和激动剂NN9056与A型人源缩胆囊素受体（Cholecystokinin receptor，CCKAR）结合的3个晶体结构，以及多肽激素CCK-8的CCKAR分别与3种不同G蛋白（Gs、Gi、Gq）偶联复合物和多肽Gastrin-17分别与B型缩胆囊素受体（CCKBR）和两种G蛋白（Gi、Gq）形成复合物的5个冷冻电镜结构。两项研究揭示了多种多肽和小分子配体特异性识别缩胆囊素受体亚型的结构基础，阐明了配体选择性和受体活化的分子机制，破解了CCKAR选择性偶联不同G蛋白的奥秘，从而为靶向该类受体的药物研发提供了重要信息。 缩胆囊素（Cholecystokinin, CCK）是胃肠激素之一。CCK和胃泌素（Gastrin）是酪氨酰磺酸化多肽家族成员，具有保守的羧基末端八肽序列。两者在胃肠道和中枢神经系统中含量丰富，通过与缩胆囊素受体结合发挥激素调节和神经递质的作用。缩胆囊素受体包括A和B两个亚型（CCKAR和CCKBR），属于A类G蛋白偶联受体（GPCR）。CCKAR特异性识别磺酸化的CCK，而CCKBR对磺酸化和非磺酸化的CCK和Gastrin均有较强亲和力。这两类CCK受体参与调控的生理功能包括饱腹感、胰酶分泌和胆囊收缩，并与焦虑、记忆和药物成瘾等相关，因而是肥胖症、2型糖尿病和焦虑症等疾病的潜在治疗靶标。高选择性CCKAR非肽类拮抗剂（如Devazepide和Lintitript）被开发用来治疗胃肠功能紊乱、神经性疼痛和胰腺癌等疾病，而其激动剂NN9056对肥胖症具有一定疗效。但由于低药效和生物利用度等问题，大多数靶向CCKR的候选药物终止于临床研究。因此，开展CCKR的结构与功能研究将深化对其配体识别机制的认识，助力相关新药的创制。 GPCR被配体激活后主要通过偶联细胞内的G蛋白进行信号转导。根据α亚基的不同，G蛋白可分为Gi/o、Gs、Gq/11和G12/13d等四亚家族。虽然目前已报道了不同GPCR与其下游G蛋白结合的大量复合物结构，但受体如何精确识别这四种G蛋白尚不清楚。由于CCKAR能够偶联这四种不同的G蛋白，因而成为研究GPCR与G蛋白选择性结合机制的模式受体。 第一项研究中，科研人员解析了磺酸化CCK-8激活的CCKAR与Gq、Gs和Gi蛋白偶联的复合物冷冻电镜结构，分辨率分别为2.9 埃、3.1 埃和3.2 埃（图1a）。结合结构分析和功能验证，该工作展示了内源多肽激素—磺酸化CCK-8（以下简称CCK-8）的结合模式：CCK-8的氨基末端由受体的三个胞外环（ECL）紧紧包裹，其羧基末端插入受体的正构口袋。科研人员还鉴定了识别CCK-8的关键氨基酸残基和磺酸化基团发挥CCK-8活性的关键位点：位于CCKAR上ECL2区域的R197与CCK-8第二位酪氨酸修饰的磺酸基通过盐键结合进而决定磺酸化多肽的高亲和力（图1b）。 此外，该研究也对CCKAR选择性偶联Gq、Gs和Gi的分子机理进行了阐述，并提出ICL3参与CCKAR与Gq偶联的新机制。科研人员发现，偶联三种不同G蛋白的受体呈现相似的激活构象，然而受体与不同G蛋白结合界面的面积显示Gq > Gs > Gi的趋势。与之一致，CCKAR与其主要下游信号蛋白Gq偶联时产生的最大的激活效应（Emax）显著高于Gs和Gi。上述结果支持Gq是CCKAR主要偶联的G蛋白类型，明确了接触面积在G蛋白选择性识别中的作用。该工作进一步证实了Gq、Gs和Gi蛋白α亚基α5螺旋的末端弯钩（Wavy hook）是CCKAR对G蛋白选择性的参与者（图1c）。在CCKAR与Gq的复合物中，科研人员还发现CCKAR胞内环ICL3的I296与Gαq亚基的一个疏水结合口袋结合，这是首次在GPCR结构中观测到ICL3与Gα亚基的相互作用方式（图1d）。相反，由于Gαs和Gαi与Gαq在该疏水口袋残基组成的差异，CCKAR的相应ICL3区域与Gs和Gi不存在该疏水作用，说明ICL3决定了G蛋白之选择性。 第二项研究中，科研人员解析了CCKAR与小分子拮抗剂Devazepide、Lintitript和激动剂NN9056结合的三个晶体结构，以及结合多肽Gastrin的CCKBR分别与Gi和Gqo偶联的两个复合物冷冻电镜结构（图2a-e）。该工作揭示出多肽和小分子拮抗剂识别CCKR的分子机制，发现ECL2是CCKAR和CCKBR选择性识别多肽配体的决定因素。ECL2上的H207与多肽中D2形成的氢键决定了CCKBR对CCK-8、CCK-8ns和Gastrin-17的高亲和力（图2f），而ECL2上的R197与多肽中Y7的磺酸基形成的盐键决定了CCK-8对CCCKAR的高选择性（图2g）。同时，科研人员还发现N3336.55和R3366.58在CCKAR识别Devazepide和Lintitript过程中发挥了关键作用，为后继选择性靶向药物的开发奠定了基础。 此外，科研人员通过比对CCKAR结合拮抗剂Devazepide的结构、CCKAR结合激动剂NN9056的结构以及CCKAR同时结合激动剂CCK-8ns和Gq蛋白的结构，结合分子动力学模拟实验，阐释了CCKAR逐步激活的过程。相对于拮抗剂，激动剂在结合口袋中结合更深（图2h），随后引起PIF和FxxCWxP保守基序的变化（图2i和2j），进而导致受体胞内部分发生TM6和TM5向外以及TM7向内移动的激活态构象变化，从而揭示了CCKAR逐步激活的分子机制。 研究工作得到国家重点研发计划、国家卫健委科技重大专项、国家自然科学基金委、中科院战略性先导科技专项和上海市科技重大专项等的资助。 论文链接：1、2 图1.内源多肽CCK-8活化的CCKAR与和不同G蛋白偶联的冷冻电镜结构 图2.CCKR分别与小分子拮抗剂和多肽激动剂结合的三维结构
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责任编辑：阎芳
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