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2024-03-07 17:58:24
基因后的Cre+及Cre-分别代表什么含义？ - 知乎
基因后的Cre+及Cre-分别代表什么含义？ - 知乎首页知乎知学堂发现等你来答切换模式登录/注册科研研究生医学基因编辑基因后的Cre+及Cre-分别代表什么含义？在阅读文献时，看到有描述小鼠种类的“Areg fl/fl Zbtb16-cre+ and Zbtb16-cre- animals”的表达，Areg f…显示全部 关注者5被浏览40,953关注问题写回答邀请回答好问题添加评论分享3 个回答默认排序fallacy爱自己是终生浪漫的开始 关注在基因编辑实验中，Cre表达是一种常用的基因操作技术。Cre是一种酶，它可以识别和切割DNA中特定的序列（称为LoxP位点），从而删除、转座或激活基因。在你所看到的文献中，“Zbtb16-cre+”和“Zbtb16-cre-”指的是两种小鼠，它们分别含有不同版本的“Zbtb16-cre”基因。在这种情况下，“+”表示小鼠携带该基因，而“-”表示小鼠不携带该基因。具体来说，“Zbtb16-cre+”小鼠携带了“Zbtb16-cre”基因，这个基因可以产生Cre酶，因此可以用Cre/LoxP技术操作其基因。而“Zbtb16-cre-”小鼠则不携带该基因，所以不能用Cre/LoxP技术操作其基因。总之，“Zbtb16-cre+”和“Zbtb16-cre-”分别代表携带和不携带Cre基因的小鼠，这对于基因编辑实验中的Cre/LoxP技术非常重要。发布于 2023-04-23 20:07赞同 211 条评论分享收藏喜欢收起MedSearch医学搜索引擎已认证账号 关注在小鼠遗传学研究中，Zbtb16-cre+/-通常指带有Zbtb16驱动的Cre重组酶表达的小鼠，其中"+"表示该小鼠为杂合子，即在一对等位基因中只有一个基因表达Zbtb16-cre，而"-"则表示该小鼠为纯合子，即在一对等位基因中都没有表达Zbtb16-cre。Cre重组酶是一种酶，能够催化DNA重组过程，其中Cre重组酶的表达由特定的启动子或调节元件控制。因此，在Zbtb16-cre+/-小鼠中，Cre重组酶的表达受到Zbtb16基因启动子的调节，可以实现特定组织或细胞类型的基因敲除或转录调控。综上，Areg fl/fl Zbtb16-cre+/-和Zbtb16-cre-小鼠通常是指在Areg基因敲除和Zbtb16启动子驱动的Cre重组酶表达方面存在差异的小鼠。其中Areg fl/fl表示对Areg基因进行了纯合子敲除，Zbtb16-cre+/-表示该小鼠为Zbtb16驱动的Cre重组酶表达的杂合子。发布于 2023-04-24 17:11赞同 7添加评论分享收藏喜欢收起
又见Cre！Cre/Loxp系统应用全攻略 | 知识点分享 - 知乎
又见Cre！Cre/Loxp系统应用全攻略 | 知识点分享 - 知乎首发于基因治疗CRO切换模式写文章登录/注册又见Cre！Cre/Loxp系统应用全攻略 | 知识点分享和元生物已认证账号优惠活动火热进行中，点击以下链接了解活动详情在进行分子表达操控中，经常听到或使用到的一个技术便是Cre/Loxp或Flp/FRT重组酶系统。简单来说，这类重组酶系统是通过特异位点重组酶(Site-specific recombinases, SSRs)介导重组酶特异识别位点(Recombination tar-get sites, RTs)间的重组，来实现特异位点的基因敲除、基因插入、基因翻转和基因易位等操作。由于该技术能够有效克服其他类型重组技术的非特异性或重组效率低等缺点，近年来已逐渐在功能基因研究领域占据了主导地位。和元生物·元载体，实业报国！AAV包装3980元、慢病毒包装1980元，好用不贵，只为让基因递送触手可及在进行分子表达操控中，经常听到或使用到的一个技术便是Cre/Loxp或Flp/FRT重组酶系统。简单来说，这类重组酶系统是通过特异位点重组酶(Site-specific recombinases, SSRs)介导重组酶特异识别位点(Recombination tar-get sites, RTs)间的重组，来实现特异位点的基因敲除、基因插入、基因翻转和基因易位等操作。由于该技术能够有效克服其他类型重组技术的非特异性或重组效率低等缺点，近年来已逐渐在功能基因研究领域占据了主导地位。Cre-loxP的基本原理Cre（Cyclization Recombination Enzyme）是一种重组酶，来源于P1噬菌体，其基因编码区序列全长1029bp，为38kDa大小的、由343个氨基酸组成的多肽单体蛋白。Cre重组酶的C-末端结构域包含催化活性位点，能够催化DNA分子中特定位点之间的重组，同时，Cre还能识别特异的DNA序列，即loxP位点，使两个loxP位点间发生基因重组。LoxP是Locus of X-overP1的缩写，是位于P1噬菌体中长度为34bp的一段序列，由两个13bp的反向回文序列和8bp的中间间隔序列共同组成，反向回文序列是Cre重组酶的识别和结合区域，间隔序列决定LoxP序列的方向。Cre/loxP诱导基因重组的方式一般而言，当细胞基因组内存在两个LoxP位点时，Cre重组酶会诱导两个LoxP位点间的序列发生重组。重组的结果取决于两个loxP位点的方向，主要有以下几种可能：① 如果两个LoxP位点位于一条DNA链上且方向相同，Cre重组酶能有效地删除两个LoxP位点间的序列（Deletion）（图1A）；② 如果两个LoxP位点位于一条DNA链上但方向相反，Cre重组酶能诱导两个LoxP位点间的序列翻转（Inversion）（图1B）；③ 如果两个LoxP位点分别位于两条不同的DNA链或染色体上，Cre重组酶能诱导两条DNA链发生交换或染色体易位，即基因转座（Translocation）（图1C）④ 如果四个loxP位点分别位于两条不同的DNA链或染色体上，Cre重组酶能诱导loxP间的序列互换（cassette exchange）（图1D）。 图1 Cre-loxP诱导基因重组的方式Cre-LoxP系统可以实现对基因的操控，根据Cre重组系统诱导基因重组的方式，我们可以通过如下三种策略实现Cre依赖的基因表达：01LSL序列（条件性基因选择）将LoxP2和转录终止信号盒（Transcription STOP cassette）插入启动子和目的基因之间，转录终止信号盒两端各有一个同向的LoxP位点，组成LoxP-STOP-LoxP-gene模式，即LSL序列。此情况下，在无Cre酶存在的细胞中，转录终止信号盒下游靶基因完全不表达，但如果细胞中含有Cre酶，基因重组中的Deletion过程发生，移除转录终止信号盒，进而表达目的基因。这是一种简单有效的办法，我们可以通过LSL的设置，有选择性地在某些细胞中表达基因。 图2 Cre依赖的基因表达-LSL策略02DIO/DO序列通过引入两对不相容的反向Lox位点LoxP和Lox2272，经过两组Lox位点的两轮重组可达到一种稳定状态。也就是可以通过Cre重组酶的存在与否来控制基因的表达。这种策略被称为DIO（Cre-on）或DO（Cre-off）。在这种策略下，任一对Lox位点间的序列会在Cre的作用下发生可逆的快速翻转，之后Cre重组酶马上不可逆地切割翻转后的同向Lox位点，只留下翻转后的基因和单独的LoxP、Lox2272位点，防止基因的再次翻转。这种巧妙的设计让科研人员可以在病毒载体中构建DIO和反向基因，感染Cre阳性细胞后，可以让Cre阳性的细胞表达基因，是为DIO结构；如果预先包装的基因是正向，那么Cre阳性的细胞则不表达基因，其余细胞表达基因，是为DO结构。因此，人为操控基因表达变成了现实。图3借助LoxP和Lox2272的FLEX策略实现Cre依赖的基因表达（Scott M. Sternson, et al., J. Neurosci., 2008）03MADM系统双标记嵌合体分析MADM（mosaic analysis with the double markers）系统，是基于Cre诱导发生Translocation过程实现的。通过同源重组将两个相互嵌合的标记基因（荧光蛋白）分别定位到同源染色体上的相同位点，位于同一条DNA链上的荧光蛋白N端（C端）和另一种荧光蛋白N端（C端）之间插入一个Loxp位点。在没有Cre的情况下，不表达功能性的GFP或RFP；但在特定时期、特定细胞中表达Cre时，Cre能诱导带有两种不同荧光蛋白N端的DNA链与另一条带有相同荧光蛋白C端的DNA链在细胞有丝分裂G2期发生重组，使得两个子代细胞分别表达有任一种有功能性的荧光蛋白（称为：X-segregation），或者其中一个子代细胞表达两种荧光蛋白而另一种子代细胞不带任何功能性荧光蛋白（称为：Z-segregation）。另外，重组也可能发生在细胞周期的G1期或者G0期，在这种情况下，细胞同时表达两种荧光蛋白。图4 MADM系统（Zong Hui, et al., Cell., 2005）Cre/loxp系统的应用通过病毒引入Cre或loxP元件，结合一种转基因小鼠可达到对某类细胞进行特异性标记或基因操作的目的。LSL策略应用mT/mG（ROSA-pCA-loxp-mT-pA-loxp-mG-pA）鼠是一种双荧光报告鼠，这种鼠在正常情况下表达定位在膜上的红色荧光蛋白（TdTomato），而当细胞表达Cre后，则表达定位在膜上的绿色荧光蛋白（GFP）。Alb（血清蛋白）为肝实质细胞特异性启动子，将rAAV2/8-Alb-Cre病毒尾静脉注射mT/mG小鼠，可发现特异性感染小鼠肝脏组织（绿色），而心脏组织未被感染（红色）。图5肝脏组织（左）、心脏组织（右）病毒产品rAAV2/8-Alb-Cre实验动物mT/mG鼠注射方式尾静脉注射感染部位肝脏组织病毒用量2E+11VG/只管吉松教授团队将AAV-hSyn-Cre注射于 Ash1lfl/fl小鼠右侧AUD区条件性敲除Ash1l基因，发现Ash1l以细胞自主效应的方式介导皮层神经元的活动依赖的突触修剪过程。（点击阅读：Neuron | 拯救星星之子！上科大管吉松组揭示ASH1L单倍不足致小鼠自闭症的神经机制）。 图6 AAV-Cre注射Flox小鼠实现条件性敲除 （Yan Yuze, et al., Neuron., 2022）病毒产品pAAV-EF1a-DIO-EYFP-WPREpAAV-hSyn-Cre-WPRE实验动物Ash1lfl/fl小鼠注射方式脑定位注射感染部位小鼠右侧脑AUD区注射体积300nLDIO策略应用Thy1是锥体神经元的特异性启动子，在前脑、海马、杏仁核、丘脑及视网膜等区域均有丰富的表达， Thy1-cre鼠配合rAAV载体可在以上脑区实现细胞特异性标记、光遗传学和化学遗传学操纵、在体钙成像记录，或者组织特异性的基因编辑。 图7 AAV-DIO注射Thy1-Cre鼠实现特异性标记病毒产品rAAV2/9-Ef1a-DIO-mCherry-WPRE实验动物Thy1-Cre小鼠注射方式脑定位注射感染部位小鼠双侧海马注射体积200nL运用神经示踪技术对大脑特定神经环路的结构和功能进行解析时，亦可以借助Cre重组酶系统和AAV血清型（比如rAAV2/9、rAAV2/retro、rAAV2/1）结合适用，达到特异性对神经环路标记和功能研究的目的。图8 Cre-DIO系统结合病毒示踪技术实现对特异环路标记及调控（Ma Hui, et al., Proc Natl Acad Sci U S A., 2021）病毒产品rAAV2/Retro-CaMKIIα-mCherry-CrerAAV2/9-hSyn-DIO-hM3D(Gq)-GFP实验动物小鼠注射方式脑定位注射感染部位小鼠vCA1和pBLA注射体积200-300nLMADM系统应用借助心肌细胞特异性启动子Tnnt2驱动cre酶的表达，配合MADM-ML-11TG/GT鼠追踪心肌细胞细胞分裂的状态。（点击阅读：【Cell Stem Cell】鸡尾酒疗法促进心肌细胞增殖和心脏再生）。图9 MADM系统应用（Du Jianyong, et al., Cell Stem Cell., 2022）病毒产品pAdeno-Tnnt2-Cre实验动物P3 MADM-ML-11TG/GT鼠感染部位原代心肌细胞感染Cre病毒列表（部分）改造的Cre/loxP系统经过现代基因工程方法对Cre和loxP元件的改造，Cre/loxP系统实现了更加丰富的条件性重组策略。1、对Cre元件的改造：对Cre元件的改造提高了Cre重组酶的活性，并且实现了药物可诱导性。例如，通过在Cre元件上引入真核细胞核定位序列NLS，Cre重组酶能在低表达丰度下实现重组，这对于一些低丰度的启动子很重要。另外，在Cre元件的C端接上一段改造过的配体结合结构域LBD，新的融合蛋白Cre-LBD将定位在胞浆内，当人工合成的激素分子结合到Cre-LBD受体后，蛋白构象改变并进入核内，介导基因重组，目前使用最多的是tamoxifen诱导的CreERT2突变体，它的LBD来自于雌激素受体ER分子，当有tamoxifen的时候，Cre才能介导基因重组，这样通过控制tamoxifen的注射时间，可以实现对基因重组时间特异性的调控。 图10 tamoxifen诱导的Cre-ER系统（Hyeonhui Kim, et al., Lab Anim Res., 2018）2、远红外光诱导的split Cre-loxP体系：化学诱导的Cre-loxP具有细胞毒性、泄漏、脱靶等劣势，华东师范大学叶海峰研究员团队基于split-Cre重组系统和远红外光(FRL)可诱导光遗传系统建立了远红外光诱导的split Cre-loxP体系(FISC，far-red light-induced split Cre-loxP system)。在该体系中，Cre酶被分为两个片段，N端Cre融合到一个Coh2结构（CreN-Coh2）；C端Cre融合到一个DocS结构（DocS-CreC）;FRL光照时，Coh2和DocS在强亲和力的作用下结合，从而Cre酶也被重新组合，行使功能。该体系实现了条件性非侵入的基因调控目的。（点击阅读：【Nat Commun.】华师大叶海峰团队创新研究：非侵入性远红外光诱导的Split-Cre系统调控基因重组）。 图11 FISC体系（Wu Jiali, et al., Nat Commun., 2020）3、对loxP元件的改造：loxP元件也有一些突变体，间隔区和回文序列都可以进行突变，突变后的序列依然能被Cre重组酶识别和重组，但是突变的loxP序列必须和同样突变的loxP序列匹配介导基因重组，而不能和未突变的loxP序列匹配，这样将不同的loxP序列组合用于控制多个基因（如上文所述的lox2272位点），在同一Cre重组酶的作用下，可以实现多序列的基因重组，产生非常多元的重组结果。例如彩虹脑（Brainbow）技术绚丽多彩的荧光标记效果正式基于对loxP序列的改造实现。其他重组酶系统除Cre-LoxP系统外，类似的还有与Cre-LoxP系统无交叉影响的vCre-vLoxP、sCre-sLoxP系统，及Flp-FRT/F5系统和Dre-Rox1/Rox2系统，对应的表达方案分别为fDIO和dDIO系统。多套重组酶体系的存在为研究中设计多个限制条件提供了便利，灵活应用Cre、Flp、Dre重组酶系统将有助于更深入课题的开展（了解更多重组酶内容，点击阅读：【知识分享】一半海水、一半火焰，分子表达操控中高频出现的Cre、Flp、Dre等重组酶系统如何工作）。 图12 Cre\Flp\Dre系统比较（Lief E Fenno, et al., Nat Methods., 2014）参考文献[1] Front Genet. 2016 Feb 19;7:19. doi: 10.3389/fgene.2016.00019.[2] Sci Adv. 2019 Feb 20;5(2):eaat3210. doi: 10.1126/sciadv.aat3210.[3] Nat Methods. 2014 Jul;11(7):763-72. doi: 10.1038/nmeth.2996.[4] J Biol Chem. 2020 Jan 17;295(3):690-700. doi: 10.1074/jbc.RA119.011349.[5] J Neurosci. 2008 Jul 9; 28(28): 7025–7030.doi: 10.1523/JNEUROSCI.1954-08.2008[6] Lab Anim Res. 2018 Dec;34(4):147-159. doi: 10.5625/lar.2018.34.4.147.[7] Nucleic Acids Res. 2004 Nov 18;32(20):6086-95. doi: 10.1093/nar/gkh941.[8] Dis Model Mech. Sep-Oct 2009;2(9-10):508-15. doi: 10.1242/dmm.003087.[9] Nucleic Acids Res. 2011 Apr;39(8):e49. doi: 10.1093/nar/gkq1280.[10]Cell. 2005 May 6;121(3):479-92.doi: 10.1016/j.cell.2005.02.012.[11] Nat Commun. 2020; 11: 3708. doi: 10.1038/s41467-020-17530-9业务咨询更多活动详情可长按或扫描下方二维码，填写表单，我们将尽快安排专人与您联系！● 突破：山东大学脑科学团队李新钢＆王剑团队揭示抑制GBM进程的新机制● 【文库筛选】抑癌基因突变的肿瘤无法靶向？不存在的！● Sci Adv | 皮层中发现痒觉特异性神经元● 祝贺 | 罗敏敏/林睿团队开发出一系列高效感染小胶质细胞的新型rAAV载体● SARS-CoV-2新发现：四川大学华西医院刘敬平组揭示如何减弱感染后的细胞因子风暴●【Nat Commun.】震惊！铁死亡疗法竟是无间道？和元生物（股票代码：688238）成立于2013年，是一家聚焦基因治疗领域的生物科技公司，专注于为基因治疗的基础研究提供基因治疗载体研制、基因功能研究等CRO服务;为基因治疗药物，包括重组病毒载体药物、溶瘤病毒、CAR-T细胞治疗产品等的研发提供工艺开发及测试、IND-CMC药学研究、临床样品GMP生产等CDMO服务。以"赋能基因治疗，共守生命健康"为使命，以基因治疗载体研发、生产为核心，公司将坚持以客户为中心、以提供专业服务为己任，打造国际领先的基因和细胞治疗CXO集团企业，加快基因治疗的基础研究、药物发现、药学研究、临床和商业化进程，推动基因治疗行业发展，造福人类健康！赋能基因治疗 共守生命健康如您有相关业务需求可点击链接了解更多内容https://www.obiosh.com发布于 2022-08-10 14:11细胞与基因治疗生物工程酶赞同 52添加评论分享喜欢收藏申请转载文章被以下专栏收录基因治疗CRO基因治疗CRO领域文献解读、行业资讯集合、和学堂爱发呆的神经元想把一些神经可以的知识和问题汇
条件性敲除小鼠的原理、构建与应用 - 知乎
条件性敲除小鼠的原理、构建与应用 - 知乎切换模式写文章登录/注册条件性敲除小鼠的原理、构建与应用赛业生物cyagen咨询业务+v：cyagen-class（备注知乎）什么是Cre-Lox系统Cre-Lox基因重组系统是一种被广泛应用于特异性基因敲除、基因易位、基因翻转以及基因插入等操作的基因重组手段。Cre重组酶（cyclization recombination enzyme）最早于1981年在P1噬菌体中发现，该酶由343个氨基酸组成，除了拥有催化活性外，同时还可以识别特定序列：Loxp位点，该位点同样在P1噬菌体中被发现，序列长度为34bp[1]。当目的基因序列两端插入相同方向的Loxp位点，同时有Cre重组酶存在时，Cre重组酶可将两个Loxp位点之间的DNA序列剪除并重新将两端环化连接，达到特异性基因敲除的目的，如图1b所示[2]。而当目的基因序列两端插入方向相反的Loxp序列时，Cre可导致Loxp之间的序列发生反转，如图1c所示[2]。图1. Cre-Lox基因重组系统工作原理[2]利用Cre-Lox系统如何制备条件性敲除小鼠Cre-Lox系统的优势在于可以利用组织特异性启动子特异性控制Cre在特定组织的表达，以实现在特定组织细胞中对目的基因的敲除或改造，更好的规避全身敲除小鼠的胚胎致死现象。1. Cre鼠的类型及应用为了更好的控制Cre重组酶的表达时间，通过使用具有雌激素受体的突变配体结合结构域的Cre融合蛋白（Cre-ERT），可以实现对Cre活性的时间控制，该蛋白可以通过他莫昔芬诱导而被激活[1]。在无他莫昔芬诱导时，Cre-ERT融合蛋白与热激蛋白Hsp90结合，定位于细胞质中；当他莫昔芬给药诱导时，Hsp90脱离Cre-ERT融合蛋白，使Cre-ERT融合蛋白暴露核定位信号进入细胞核，发挥基因重组的作用[3]。这一融合蛋白的介入相当于为Cre-Lox系统加装了一个由他莫昔芬控制的外源开关，使得体内基因编辑更具时空灵活性。为了提升该系统的灵敏性、特异性，ER配体结合结构域被进一步突变为Cre-ERT2，该系统对他莫昔芬代谢活性物质4-羟基他莫昔芬（TAM主要通过肝脏的细胞色素P450酶代谢为活性产物4-OH-TAM）的敏感性提升了10倍[4]。同样的，Cre-ERT2并非完美无暇，Poorva Sandlesh等人研究发现CreERT2-Lox系统在敲除SSRP1的应用中，存在效率过低问题[5]。Cre鼠常用于与Flox小鼠杂交进行条件性的目的基因敲除，但也有研究将Cre鼠用于切割位于报告基因前的终止序列，以达到荧光标记特定细胞的目的，进一步研究细胞命运。2. Flox鼠与Cre鼠的配繁在实际应用中，通过不同的Flox鼠与Cre鼠的配繁可以实现多种研究目的，通过组织/细胞特异性Cre鼠敲除特定组织/细胞群体的特定基因是最为常见的一种。F0代与野生鼠互配获得F1代杂合子，F1代杂合子（flox/+）互配得到F2代纯合子（flox/flox），F2代纯合子（flox/flox）与全身/组织特异性工具鼠交配获得F3代（flox/+, Cre），F3代（flox/+, Cre）互配得到F4代（flox/flox, Cre），即cKO/cKI纯合子。图2. 条件性敲除（敲入）鼠建系流程CAUTION！（1）如果是通过打靶构建的全身/组织特异性工具鼠，要注意选择与目的基因不在同一条染色体上，以免繁殖不到cKO/cKI纯合子。（2）有生殖细胞泄露风险的Cre工具鼠，繁殖时按照建议性别选择不同基因型鼠。（3）诱导型的Cre工具鼠，需要加药后才能实现特异组织删除。（4）F1代若有剩余的flox杂合鼠（flox/+），或想要加快获得目标鼠，第2步可以用flox/+直接配Cre工具鼠，可缩短一代周期。（5）即使是组织特异性工具鼠，也可能在其他组织有泄露表达的风险。条件性敲除小鼠的应用在科研中，条件性敲除小鼠的应用对探究基因或蛋白在体内作用及分子机制有着重要意义。下文以赛业生物客户发表在《Nature Communications》杂志上的一篇题为Hematopoietic PBX-interacting protein mediates cartilage degeneration during the pathogenesis of osteoarthritis的文章为例，对条件性基因敲除小鼠的应用加以说明。之前的研究认为HPIP蛋白主要在肿瘤发生发展中起调节作用，该文为了研究HPIP在骨关节炎中的作用，分析了118对骨关节炎软骨组织及相应非病变样本中HPIP的表达水平。结果显示，骨关节炎软骨中HPIP的表达明显高于非病变组织。而且，HPIP的表达随着骨关节炎的发展而逐渐增加，而细胞外基质（ECM）组分COL2A1和ACAN的表达逐渐减少，表明它可能参与关节软骨退化中的ECM降解。研究者通过将Col2a1-CreERT2基因型小鼠与HPIP flox/flox小鼠杂交两代后获得Col2a1-CreERT2; HPIP flox/flox小鼠，即诱导后可以在在ECM中敲除HPIP基因的基因工程小鼠模型，染色结果表明，与对照组小鼠相比，敲除组小鼠表现出明显的骨骼异常，敲除组小鼠肱骨、股骨、胫骨和椎骨等骨骼的长度比对照小鼠短10-21%。随后研究人员分别将两组小鼠膝关节中的前十字韧带切除，并检查手术后的软骨厚度和覆盖面积。结果显示在手术后4周和8周时，对照组小鼠的软骨厚度和覆盖面积都低于条件性敲除组小鼠。一系列结果均指出，HPIP基因的条件性敲除可以防止骨关节炎的发展。该文章对于基因工程小鼠的应用有效的弥补了临床样本的病程中相关数据，与临床样本联合揭示了HPIP在骨关节炎中的作用。图3. HPIP的敲除可以防止骨关节炎的发展[6]本文来自赛业生物如果你也对各类动物实验/细胞与基因治疗CRO及技术服务感兴趣，那就快快关注我们的知乎账号：赛业生物cyagen吧！干货高频分享，总有你需要的~还可以关注我们的微信公众号：赛业生物订阅号，针对多类目内容设置了多项趣味专栏，妈妈再也不用担心我找不到资料啦！现在添加小助理微信：cyagen-class/18028869537（备注知乎）即可咨询业务，还可以进入交流群共同学习，参与多种福利活动~点赞、推荐、么么哒mua! (*╯3╰)编辑于 2024-02-02 13:24・IP 属地广东基因编辑生物实验动物赞同 12018 条评论分享喜欢收藏申请
耐碳青霉烯肠杆菌（CRE）
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【小鼠大学问】诱导型Cre，给基因敲除装个“开关” - 知乎
【小鼠大学问】诱导型Cre，给基因敲除装个“开关” - 知乎首发于小鼠大学问切换模式写文章登录/注册【小鼠大学问】诱导型Cre，给基因敲除装个“开关”南模生物专注模式生物，成就科学价值看了我们上期的介绍，你应该已经了解在Cre 工具鼠中 Cre 重组酶上游的启动子决定了 Cre 在哪种组织或细胞类型中表达，这是基因敲除的空间特异性。那么条件性基因敲除的时间特异性又是怎么实现的呢？今天我们就来说一说基因敲除的时间控制。诱导型 Cre-loxP 系统介导了时间特异性基因敲除。通过对给予诱导剂的时间的控制，人为操控基因敲除的发生。诱导型Cre有哪几种类型？启动子激活型通过诱导剂来调节驱动 Cre 重组酶的启动子活性。例如：四环素诱导型、干扰素诱导型配体诱导型通过将 Cre 重组酶与激素受体的配体结合域（ligand-binding domain，LBD）相融合，形成定位于胞浆的融合蛋白，只有在激素诱导后，融合的 Cre 蛋白才会通过构象变化从锚定蛋白 HSP90 上解离下来，进入细胞核，识别loxP位点并发生重组。例如：雌激素诱导型四环素诱导型 tetO-Cre将四环素调控系统与Cre-loxP系统相结合，一般需要两种转基因小鼠交配使用：一种是由四环素响应启动子元件（TRE，也叫 tetO）控制的 Cre 工具鼠（TRE-Cre，也叫 tetO-Cre）。另一种是由组织特异性启动子驱动的表达四环素转录活化因子 rtTA 或 tTA 的小鼠。tetO 本身缺乏启动子活性，无法独立驱动下游基因的表达。只有当具有转录激活功能的rtTA或者tTA与tetO结合后才能激活Cre的表达。 rtTA 或 tTA 与tetO的结合受四环素或四环素衍生物强力霉素（Dox）的调节。tTA 在没有 Dox 的时候与 tetO 结合诱导 Cre 表达，有 Dox 的时候不能与 tetO 结合，Cre 不表达；rtTA 与 tTA 相反，有 Dox 的时候与tetO结合，诱导 Cre 表达,没有 Dox 的时候与 tetO 不结合，Cre 不表达。因此，在 tetO-Cre 与组织特异性 rtTA （或 tTA ）双转基因阳性小鼠中，可以通过给予或撤离 Dox 来控制 Cre 重组酶在特定组织中产生的时间。看起来有点复杂有木有？希望下面这张示意图能帮你理解tetO-Cre在CKO中的应用。tetO-Cre 与 rtTA 小鼠联用，在给予 Dox 的情况下敲除目的基因。图片来自《Transgenesis Techniques Principles and Protocols 》Third Edition所以，利用四环素诱导条件性基因敲除需要3种基因工程小鼠同时使用，相互交配才能最终获得 flox 纯合且 Cre 与 rtTA（或 tTA）双阳性的子代小鼠。整个系统较为复杂，繁育及基因型鉴定工作量都比较大。干扰素诱导型 Mx1-Cre干扰素诱导是通过 Mx1 基因启动子对于干扰素的响应来实现的。 Mx1-Cre 小鼠在一般状态下不表达 Cre 重组酶，但可以通过干扰素-α、干扰素-β 或人工合成的双链 RNA类似物 poly I:C 的处理而诱导表达 Cre。利用 Mx1-Cre 虽然可用于在发育过程中的任意时间点诱导目的基因敲除小鼠，但仅限于在响应干扰素的细胞中。目的基因敲除的效率也依赖于组织或细胞对干扰素的响应水平或干扰素响应细胞的数量。Detection of the Extent of Cre-Mediated Recombination in Different Tissues of pIpC-Treated Arnt-Floxed/Mx1-Cre Mice.图片来自Mol Endocrinol. 2000 Oct;14(10):1674-81.雌激素诱导型 Cre-ER将雌激素受体（estrogen receptor，简称ER）的配体结合区与 Cre 重组酶相融合，形成定位于胞浆中的融合蛋白（Cre-ER）。这样就通过控制雌激素的注射时间，可以实现对基因重组时间特异性的调控。可是机体自身不是就有雌激素分泌吗？为了避免内源雌激素的干扰，在人ER的配体结合区做一个点突变（G521R）就可以使 Cre-ER 只响应外源的人工合成雌激素（比如：Tamoxifen、4-OHT）的诱导，命名为 Cre-ERT。之后，另一种 LBD 突变体融合蛋白被证明对 4-OHT 具有远高于 Cre-ERT 的敏感性，这种突变体就是大名鼎鼎的 Cre-ERT2 啦。它带有人 ER LBD 中的3个点突变：C400V/M543A/L544A。Cre-ER 系统，特别是 Cre-ERT2 ，是目前应用最广泛的诱导型 Cre 系统。其较之四环素诱导型 Cre，系统更为简单。我们只需要将 Cre-ERT2 设计在组织特异性启动子之后，并与 flox 小鼠交配，就可以通过在特定时间点给予 Tamoxifen 来最终实现对靶基因的时空特异性敲除啦。图片来自《Transgenesis Techniques Principles and Protocols 》Third Edition编辑于 2020-04-01 16:06生物学自然科学基因工程赞同 1019 条评论分享喜欢收藏申请转载文章被以下专栏收录小鼠大学问专注小鼠模型的研发、饲养繁育和分
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一文读懂耐碳青霉烯肠杆菌感染治疗进展
2018-10-23 19:40
来源：丁香园
作者：沃熙
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过去数十年，耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌（CRE）所致医院感染已经爆发了多次，并在多国流行。对肠杆菌科细菌来说，碳青霉烯类药物耐药主要是由于细菌产碳青霉烯酶（包括 KPC、MBLs 和 OXA），较少的是由于细菌缺乏外膜蛋白的表达。肺炎克雷伯菌是最常见的产碳青霉烯酶的肠杆科细菌，是医院相关感染高死亡率的主要原因。目前由于缺乏前瞻性临床试验的数据，观察性研究存在局限性，故 CRE 感染的最佳临床处理策略尚未完全确定。故 Mario Tumbarello 教授等人综述现有证据来回顾抗菌药物治疗 CRE 的有效性，文章发表在近期的 Curr Opin Infect Dis 杂志上。抗菌药物治疗和结局单药 vs. 联合治疗尽管多粘菌素、替加环素、磷霉素和/或氨基糖苷类（主要是庆大霉素）的耐药率各不相同，但他们都是治疗 CRE 感染的选择。单药方案疗效的不确定性促使了通过多药联合的协同或附加作用治疗 CRE 感染。目前大多数观察性研究显示多药治疗 CRE 感染生存率更高，但由于研究方法的异质性（包括所定义的抗菌药物的折点、感染发病到起始治疗的间隔、联合用药的时间、死亡评估时间点）、缺乏对混杂因素的控制等原因，并不能得出可靠的结论。近期的研究显示：当患者有更高的死亡率评分和非尿路、非胆源性感染时，多药联合治疗 CRE 对比单药治疗可以降低死亡率。虽然多药联合治疗对于 CRE 感染的高危患者可能是合理的，但单药治疗对于低风险患者可能已经足够。需要注意的是，新的复方制剂头孢他啶-阿维巴坦和美罗培南-vaborbactam 并没有用于这些研究，所以他们作为单药方案的疗效的结论是未知的。多粘菌素多粘菌素 E 和 B 在治疗 CRE 感染中扮演了重要的角色，因为很可能他们是唯一有效且可及的药物。现有证据证实多粘菌素 E 的肾脏毒性比多粘菌素 B 大，但是他们的临床疗效相似。近期的一个 meta 分析显示多粘菌素 E 单药治疗 CRE 感染对比包括多粘菌素 E 的多药联合方案有更高的死亡率。另一项包括 MDR/XDR（多重耐药/泛耐药）革兰阴性菌感染研究的 Meta 分析也得到了相同的结论。亚组分析提示：包含高剂量多粘菌素的多药方案对比多粘菌素单药治疗血流感染、鲍曼不动杆菌感染和亚洲人群，有更低的死亡率，而其他亚组死亡率差异没有统计学意义。研究未能解释造成异质性的因素。一个随机对照研究探讨了多粘菌素 E 对比多粘菌素 E 联合美罗培南治疗碳青霉烯类不敏感的革兰阴性菌所致菌血症、肺炎和尿路感染。多粘菌素 E 联用美罗培南治疗鲍曼不动杆菌所致严重感染并不能提高临床治愈率。研究并没有足够效力来证实其对于肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌感染的疗效。基于药动学、药效学和临床数据，标准剂量多粘菌素 E 方案包括给予负荷剂量和高剂量进行维持。目前也有多粘菌素 E 耐药的 CRE 感染爆发的报道，这些感染被认为是与前期多粘菌素 E 的暴露、质粒介导的 mcr 基因、更高的死亡率有关。多粘菌素 E 对于控制低风险的 CRE 感染有效，对于产 MBL 为主导的高风险 CRE 感染地区仍是一个重要的药物选择，因为新的复方制剂头孢他啶-阿维巴坦和美罗培南-vaborbactam 对这些病例无效。替加环素在过去数十年中，甘氨酰环素类抗菌药物替加环素被认为是治疗 CRE 和其他多种耐药革兰氏阴性菌所致严重感染的最后一道防线之一。一项纳入 21 个研究的 meta 分析显示替加环素对比其他抗菌药物治疗 CRE 感染死亡率差异无统计学意义。多药联合治疗时，包含替加环素的方案有更高的生存获益。但研究存在异质性。标准剂量的替加环素治疗血流感染和肺炎，血药浓度和肺组织浓度可能不足。高剂量替加环素方案（负荷剂量 200 mg，100 mg 一天两次维持）已经被推荐用于严重 CRE 感染、血流感染、肺炎。现有数据显示，这种获益可能被它所产生的严重恶心和纤维蛋白原水平降低所抵消。氨基糖苷类氨基糖苷类对于 CRE 的敏感性相差很大。在产 NDM 的 CRE 中，16 sRNA 甲基转移酶的表达尤其常见，它们对所有氨基糖苷类抗菌药物都耐药。氨基糖苷类单药对比多粘菌素 B 治疗尿路感染有更高的临床有效率，但是药物的药动学限制了其用于其他类型的 CRE 感染。氨基糖苷类单药用于其他感染的死亡率高达 80%，故需要加入其他具有体外活性的抗菌药物作为联合治疗方案。氨基糖苷类最低死亡率的报道是联用美罗培南（美罗培南 MIC 值 ≤ 8 μg/ml）。氨基糖苷类雾化可以用于 CRE 肺炎。所有氨基糖苷类药物都需要进行血药浓度监测。为了达到最优的疗效，一天一次给药要求庆大霉素峰浓度为 15-20 μg/ml，妥布霉素峰浓度为 20-40 μg/ml。为了避免肾毒性，需控制氨基糖苷类药物的谷浓度（庆大霉素或妥布霉素 ≤ 1 μg/ml，阿米卡星 1-4 μg/ml）。对于 CRE 脓毒症的患者，剂量可以提高（庆大霉素 5-7 mg/kg，阿米卡星 15-30 mg/kg 持续 1 小时输注/每天）保证庆大霉素和阿米卡星的峰浓度为 30 μg/ml 和 60 μg/ml。磷霉素磷霉素对 CRE 有很强的体外活性。严重感染的患者可以给予 6-8 g q8 h 持续 2-4 小时输注以保证峰浓度达到 260-442 μg/ml。危重患者磷霉素的表观分布容积增加 50%，会减少三分之一的峰浓度。%T ＞MIC 大于等于 70% 是一个有效的药动学参数来进行预测磷霉素的临床治愈率。磷霉素治疗 48 例 XDR、PDR 的 CRE 所致脓毒症或感染性休克的 ICU 患者，临床成功率为 54.2%，30 天死亡率为 37.5%，3 例患者出现耐药。与其他抗菌药物联合使用可能可以降低死亡率，降低获得性耐药的风险。碳青霉烯类药物治疗 CRE有很多研究证实了碳青霉烯类药物治疗 CRE 感染的结局与 CRE 菌株碳青霉烯类药物 MIC 值有关。值得注意的是，碳青霉烯类药物均使用了高剂量、延长输注并联合使用了其他敏感的抗菌药物。数个研究表明在联合碳青霉烯类药物治疗 CRE 时，CRE 的碳青霉烯类 MIC 值 ≤ 8 mg/l 的患者比碳青霉烯类 MIC 值 ≥ 16 mg/ml 的患者有更低的死亡率。包含高剂量碳青霉烯类的多药联合方案似乎比不含碳青霉烯类的方案有更好的临床结局。双碳青霉烯类治疗Bulik 和 Bicolau 首先革命性地提出了厄他培南/多尼培南联用治疗 XDR 和 PDR 的 CRE，原因在于厄他培南对于 KPCs 的高度亲和力，可以阻止 KPC 作用于第二种碳青霉烯类药物。体外试验表明，厄他培南联合其他碳青霉烯类药物对丝氨酸 β-内酰胺酶有效，而对于 MBLs 无效。厄他培南（1 g q24 h 30 min 输注）加上美罗培南（2 g q8 h 3 h 输注）治疗 211 例 CRE 感染（50% 为菌血症）有良好的疗效（临床治愈率 70%，死亡率 26%）。其中三分之一的患者使用了双碳青霉烯类药物联合一种或多种敏感的抗菌药物。而当仅使用双碳青霉烯类抗菌药物治疗 PDR 感染和感染性休克患者时，临床治愈率和死亡率对比对照组并无差异。碳青霉烯类药物 MIC 值 ≤ 128 μg/ml 与治疗结局无关。头孢他啶-阿维巴坦头孢他啶和阿维巴坦（CAZ-AVI）的复方制剂（第一个非β-内酰胺类β内酰胺酶抑制剂）可以抑制 ESBLs，AmpC，KPC 和大多数的 OXA-48，但对于 MBLs 无效。FDA 和欧洲药品管理局（EMA）已经批准 CAZ-AVI 治疗复杂性尿路感染，复杂性腹腔感染，医院获得性和呼吸机相关性肺炎，EMA 还扩大了其适应症包括治疗没有其他选择的需氧革兰氏阴性菌所致感染。目前，CAZ-AVI 治疗 CRE 感染的临床数据主要基于 458 名患者的治疗，其中约三分之二为菌血症。亚组分析显示 CAZ-AVI 联合其他敏感抗菌药物对比 CAZ-AVI 单药治疗的临床治愈率差异没有统计学意义。数个研究显示 CAZ-AVI 对比其他药物治疗 CRE 感染有更低的死亡率。CAZ-AVI 治疗失败的危险因素包括肺炎和肾脏替代治疗。几乎所有的研究都是回顾性研究或观察性研究，缺乏对照组。由于临床治愈率和死亡率的差异很大，并且同时使用了不同敏感性的抗菌药物，没有进行耐药的监测，故需要前瞻性、随机对照研究来证实 CAZ-AVI 的疗效。同时，CAZ-AVI 不应不加选择地成为危重患者的初始治疗。美罗培南-Vaborbactam美罗培南-vaborbactam 是碳青霉烯类与β内酰胺酶抑制剂的复方制剂，体外对产 KPC 的 CRE 有抗菌作用，但对产 MBLs（NDM 或 VIM）或 OXA-48 的 CRE 无效。III 期临床试验 TANGO I 证实了美罗培南-vaborbactam 在复杂性尿路感染，包括多种病原菌所致的急性肾盂肾炎中的疗效。而其对抗 CRE 的疗效则是在 TANGO II 试验中被证实。2017 年，基于以上证据，FDA 批准了美罗培南—vaborbactam 用于治疗敏感细菌所致的复杂性尿路感染。复方制剂耐受性好，其毒性、药动学数据、药效学均优于其他抗 CRE 的药物。小结治疗 CRE 感染需要根据不同的感染类型、严重程度、致病菌的敏感性、患者的一般情况来综合考虑。多药联合治疗可能对高危患者（比如感染性休克）获益，但单药治疗可能对于其他患者有效。近期获批上市的复方制剂 CAZ-AVI 和美罗培南-vaborbactam 对产 KPC 的肠杆菌科有较好的疗效，CAZ-AVI 同样抑制 OXA-48。目前的临床数据表明尽管 CAZ-AVI 已有获得性耐药的报道，但对比其他抗菌药物仍然可以提高生存率。但两种复方制剂对 NDMs 和其他 MBL 均无效，提示在产这类酶菌株流行的亚洲或其他地区使用可能效果不佳。也希望有前瞻性、随机临床试验来进一步证实疗效。
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https://www.modelorg.com/portal/article/index/id/2375/cid/28.html组织特异性 Cre 真的那么特异吗？师妹：师兄，应该是肝脏特异表达的 Cre，怎么好像在脑里也有表达？师兄：唉，理想是丰满的，而现实往往是骨感的。其实，Cre 的非特异性表达是普遍存在的啊！大部分 Cre 品系在其它组织中也有 Cre 活性。由于 Cre 的非特异性表达导致基因敲除的脱靶，有可能在你不自知的时候直接影响到你的实验数据。比如，受神经元特异性 Emx1（empty spiracles homolog 1）启动子驱动的 Cre 小鼠，除了在新皮质和海马中高表达 Cre 以外，在肾脏和胸腺中也会表达 Cre。师兄：如果 Cre 的脱靶发生在生殖细胞里，那就有可能直接得到全身性敲除小鼠了。还是以 Emx1-Cre 为例，研究发现在一小部分生殖细胞中也有 Cre 表达，并且雄性与雌性都可能出现这样的脱靶。师妹：那我怎么知道有没有发生生殖系脱靶呢？师兄：我们可以通过 PCR 方法发现是否发生了全身敲除。只需要在 flox 区域的上下游分别设计一条上游引物和一条下游引物（下图橙色箭头）。如果发生了全身敲除，那么在做基因型鉴定 PCR 时，会出现一条最短的条带。将带有这条短带的小鼠移除即可。我用的 GFAP-Cre 和你用的 GFAP-Cre 不一样？师妹：我和文献里用的明明都是 GFAP-Cre，为什么表型差别这么大？师兄：看看你买的 GFAP-Cre 全名叫啥？从哪来的？不同机构构建的 Cre 品系，Cre 的表达谱都不一样！虽然 Cre 都受 glial fibrillary acidic protein promoter 驱动，但 Tg(GFAP-cre)8 Gtm 主要在星形胶质细胞中表达 Cre；而 Tg(GFAP-cre)25Mes 除了在中枢神经系统中的星形胶质细胞、少突神经胶质、室管膜以及一些神经元中表达 Cre，还在心内膜、肺血管内皮细胞、肝脏门静脉周细胞、附睾管中有 Cre 表达。这差别可不是一点半点呢。图2. Cre recombinase expression in Gfap-cre mice occurs in the endocardium (p), pulmonary vascular endothelium (q), endothelial cells of the liver portal system (r), ductus epididymis (s), islets of Langerhan’s and pancreatic duct endothelium (arrowheads) (t), as well as endometr.师妹：看来购买 Cre 工具鼠可得小心谨慎。师兄：是啊，所以说前期的文献工作很重要呢！通过已发表的文献，可以知道主要在哪些组织或细胞中表达 Cre。如果找不到 Cre 的相关文献，那么保险起见，还是将 Cre 小鼠与报告基因工具鼠交配一下，看看子代双阳性小鼠里哪些组织有报告基因的表达，那么就可以大致判断这种 Cre 小鼠是否合适了。师妹：对了师兄，刚刚你那张表格是在哪里查到的？师兄：是 MGI 的 Recombinase (cre) Activity 数据库哦。http://www.informatics.jax.org/home/recombinase可以按你想要查询的组织类型或特殊的启动子名称来查询相关的 Cre 工具鼠品系，很方便呢！原来 Cre 鼠用雌鼠和用雄鼠还不一样？师妹：师兄，我应该用雄性 Cre 配雌性 flox 小鼠还是用雌性 Cre 配雄性 flox 小鼠呢？师兄：这个问题要看你使用的是哪种 Cre 啦，有的 Cre 小鼠父性遗传与母性遗传的重组效率有所差别哦。比如 EIIa-Cre，来自母本的 Cre 在肾脏、肝脏、肠、胰腺中具有广泛均匀的 Cre 活性，但在脾脏中呈马赛克式的镶嵌表达；而来自父本的 Cre 则都表现为镶嵌式的重组活性。所以用雌性 Cre 来交配效率更高。图3. 亲本的来源对 Cre 在体内的表达谱的影响。EIIa-Cre与Rosa26-LSL-lacZ交配获得子代，lacZ染色结果：(a-c) Cre 来自母本 ；(d-f) Cre 来自父本。（图片来自 Nat Commun. 2012;3:1218.）师兄：还有一些 Cre 品系在卵母细胞减数分裂后会有 Cre mRNA 或蛋白的持续存在，即使这个卵母细胞本身并不带有 Cre 转基因。这时，用雌性 Cre 小鼠与 flox 小鼠交配可以更快地直接获得全身性基因敲除小鼠，比如：Ddx4-Cre 或 Sox2-Cre。救命啊！我的 CKO 小鼠为什么基因还没被敲除？师妹：师兄，我的 Cre 到底有没有起作用啊？为什么基因还在表达？师兄：先别急，再做一次基因型鉴定试试。确定是 Flox 纯合子同时 Cre 阳性吗？师妹：我已经 P 了 3 次了，错不了。师兄：那你是怎么鉴定你要敲除的基因还在表达呢？师妹：mRNA 水平都没有变化…师兄：RealtimePCR 引物设计在哪？我记得你敲除的是基因的 exon6 吧，如果你的一对引物都设计在 exon6 之前，那么 exon1-5 还是有可能被转录出来，表达量上就可能看不出差异了。师妹：哦，我明白了，那我重新设计引物试试。一条引物放在被敲除的 exon6 上。师兄：如果真的没敲掉，说明你的 Cre 小鼠重组效率可能不容乐观啊。你也许要考虑找个全身性敲除的小鼠来交配一下，用 KO/Flox 杂合子同时 Cre 阳性的小鼠作为敲除组，这样 Cre 只需要在一个等位基因上起作用就可以了，敲除效率可能会提高一些。另外，其实不同基因的 flox 有的容易被 Cre 重组，有的则比较困难。这可能是由于染色体的状态导致 Cre 酶比较难接近 loxp 位点的关系。Cre 小鼠也会不育？师妹：师兄，我用 flox 小鼠跟 Cre 小鼠交配了，但老是得不到实验组小鼠。我为了提高阳性小鼠的比例，还特意把 Cre 小鼠自交了呢。师兄：你的 flox 基因和 Cre 不会是在同一条染色体上吧？师妹：Flox 基因在 6 号染色体，Cre 我还真没注意。Cre 如果是随机整合的，确实不好判断整合在什么地方。有可能插入到某个基因里破坏了这个基因的功能，如果是纯合子的话就可能有不育或者其它表型呢。而且如果 Cre 活性过高可能引起在基因组中未知的 loxP 位点重组，从而引发敲除或异位，严重的会影响小鼠存活。Cre 如果是 knockin 的，那从文献或资料中就能知道整合在哪条染色体上了。一般 Cre 还是用杂合子小鼠比较稳妥。广泛表达的 Cre 在所有组织表达都一样高？师妹：为什么我用 CAG-CreER 小鼠在 Tamoxifen 诱导以后，有的组织敲除的好，有些组织不是那么理想呢？师兄：你又真相了。哪怕是号称全身广泛表达的 Cre，在不同组织中还是会有所差异的。比如 CAG-CreER 在诱导后，在平滑肌、胰腺里表达要比在卵巢或脾脏中高。UBC-CreER 也有类似的情况。诱导型 Cre 其实会漏？师妹：为什么我还没给 Tamoxifen ，就已经能检测到 KO 条带了？师兄：虽然理论上 Cre-ER 在没有 Tamoxifen 诱导时应该在细胞质内，而无法进入细胞核重组 loxp 位点。但实际上还有一些 Cre-ER 的小鼠即使在未诱导状态，仍会发生不同程度的 DNA 重组，比如：Tg(Ins2-cre/Esr1)1Dam、Tg(Tyr-cre/ERT2)13Bos 等。Reference：1. Gorski JA, Talley T, et al. Cortical excitatory neurons and glia, but not GABAergic neurons, are produced in the Emx1-expressing lineage. J Neurosci. 2002 Aug 1;22(15):6309-14.2. Heffner CS, Herbert Pratt C, et al. Supporting conditional mouse mutagenesis with a comprehensive cre characterization resource. Nat Commun. 2012;3:1218.3. Liu Y, Suckale J, et al. Tamoxifen-Independent Recombination in the RIP-CreER Mouse. PLoS One. 2010; 5(10): e13533.4. Dankort D, Curley DP, et al. Braf(V600E) cooperates with Pten loss to induce metastatic melanoma. Nat Genet. 2009 May;41(5):544-52.5. Vooijs M, Jonkers J, et al. A highly efficient ligand-regulated Cre recombinase mouse line shows that LoxP recombination is position dependent. EMBO Rep. 2001 Apr;2(4):292-7.
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